[发明专利]一种快速检测人干扰素活性的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测人干扰素活性的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)植物源人干扰素的获得；(2)细胞培养及加药处理；(3)RNA提取；(4)RNA反转录cDNA；(5)Real‑Time PCR：利用qPCR试剂盒检测基因MX1、ISG15、IFITM3、APOBEC1的表达量变化。本申请中采用MX1、ISG15、IFITM3和APOBEC1基因基本涵盖了I型干扰素和II型干扰素相应刺激的代表性基因，用他们的表达情况基本可以反应干扰素的活性问题。

技术领域

本发明涉及一种利用qPCR方法检测人干扰素活性的方法，属于基因检测领域。

背景技术

药典上规定的人干扰素检测方法是细胞病变抑制法和报告基因法(适用于I型干扰素)。其中细胞病变抑制法依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，在波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。报告基因法是将含有干扰素刺激反应元件和荧光素酶基因的质粒转染到HEK293细胞中，构建细胞系HEK293puroISRE-Luc，作为生物学活性测定细胞，当I型干扰素与细胞膜上的受体结合后，通过信号转导，激活干扰素刺激反应元件，启动荧光素酶的表达，表达量与干扰素的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其发光强度，以此测定I型干扰素生物学活性。报告基因法涉及的细胞系HEK293puro ISRE-Luc比较难以构建且商业化细胞系成本较高；细胞病变抑制法用到的水泡性口炎病毒是人畜共患病毒，可在受感染的人类中导致流感样疾病，存在安全隐患。利用干扰素处理后相应刺激基因表达情况来检测干扰素活性既方便快捷，又不存在安全风险。

MX1：该基因编码一种鸟苷三磷酸(GTP)代谢蛋白，参与细胞抗病毒反应该编码蛋白由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导

ISG15：I型干扰素与其受体结合后激活酪氨酸激酶JAK-STAT信号通路，最终诱导干扰素刺激基因(interferon stimulated genes，ISG)的表达，在众多的ISG中，ISG15是第一个被鉴定出来的ISG基因，它能够编码泛素类似蛋白ISG15，该蛋白通过异肽键连接到底物蛋白上，对底物进行修饰，但并不介导蛋白质的降解。

IFITM3：干扰素诱导的跨膜蛋白3(interferon-induced transmembraneprotein3，IFITM3)属于干扰素诱导基因ISG，可以被干扰素和病毒诱导表达。

APOBEC1(Apolipoprotein B MRNAEditing Enzyme Catalytic Subunit 1)：编码一种载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽家族，是一种具有抗病毒活性的蛋白分子，主要表达与肠道和肝脏内，能导致apoB(载脂蛋白)mRNA特异性位点单个核苷酸C666转变为U，使得编码谷氨酰胺的密码子CAA转变为终止密码子UAA，导致翻译提前终止，生成apoB100蛋白的截短形式apoB48。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为了解决现有技术报告基因法中HEK293puro ISRE-Luc难以构建且商业化细胞系成本高、细胞病变抑制法存在安全隐患等技术问题，提供一种快速检测人干扰素活性的方法。

本发明的技术方案是：一种快速检测人干扰素活性的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)烟草源人干扰素的获得；(2)细胞培养及加药处理；(3)RNA提取；(4)RNA反转录cDNA；(5)Real-Time PCR：利用qPCR试剂盒检测基因MX1、ISG15、IFITM3、APOBEC1的表达量变化。