[发明专利]一种藏药小檗皮的检测引物、检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种藏药小檗皮的检测引物、检测试剂盒及检测方法，具体涉及分子生物学技术领域。一种藏药小檗皮的检测引物的正向内引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示；反向内引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。所述藏药小檗皮的检测试剂盒包括超快速核酸扩增和荧光可视化分析。本发明提供的试剂盒和方法，可以准确、有效的鉴别小檗皮的4种主流品种匙叶小檗、鲜黄小檗、甘肃小檗和刺红珠与常见的混淆品黄柏，还可以检测成药中是否含有小檗皮，采用快速核酸扩增技术和荧光可视化技术，操作简单，扩增和检测时间短，30分钟即可完成扩增和检测过程，高效快速且准确，为小檗皮主流品种和成药的检测提供可靠依据。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种藏药小檗皮的检测引物、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

小檗皮始载于《四部医典》，是藏医临床治疗“京尼萨库”病(糖尿病)及其并发症的常用药。小檗皮目前未被收入《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药分册》标准正文，仅在标准附录中规定其来源为小檗科植物甘肃小檗Berberis kansuensis Schneid.及其同属多种植物的干燥内皮，其同属植物在我国大约为200种，目前市场、藏医院和藏药厂使用的主流品种为甘肃小檗B.kansuensis Schneid.、鲜黄小檗B.diaphana Maxim.、匙叶小檗B.vernae Schneid.以及刺红珠B.dictyophylla Franch.。

由于小檗皮资源有限，品种多样，且芸香科黄皮树的干燥树皮黄柏Phellodendronchinense Schneid.与小檗皮的外形相似，经调查发现，市场上出现过以黄柏掺入小檗皮混用的情况，严重影响了药材以及成药的质量和临床疗效，此外，小檗皮作为一种常用药材，在多种藏成药中使用，而藏成药均是由几味甚至几十味药材组成，药材粉碎以后已经不能从外观形态上进行鉴别，多种药材的化合物之间可能互相影响理化鉴定结果，从外形鉴别和理化鉴别可能会存在难点，所以建立一个小檗皮药材以及藏成药中小檗皮的快速鉴定方法具有十分重要的意义。

因为DNA分子不受其他药材的干扰和影响，并且即使存在微量的DNA也可以通过PCR扩增检测，以DNA条形码、位点特异性PCR为代表的DNA分子鉴定技术已经被证明可以有效的应用于中药材以及中成药中原料药的真伪鉴别和定量分析；川贝母、乌梢蛇、蕲蛇、石斛等药材的PCR鉴别法也已被《中国药典》收载。

中国专利CN201610499262.6，公开一种鉴定小檗皮基原的检测试剂盒，是本发明的发明人的专利，但是在该专利的方法是利用通用引物对待测样品进行扩增和测序，通过手动校正，拼接序列来判断小檗皮的基原品种，所以检测过程耗费时间长，且操作复杂，结果不直观，并且无法检测成药中是否含有小檗皮药材。本发明选择采用位点特异性PCR联合荧光可视化分析技术可对小檗皮药材及其成药中的小檗皮进行检测。检测原理是利用特异性引物对小檗皮特异性DNA进行扩增，并在扩增结束后加入荧光染料对扩增产物进行检测，检测结果可以在荧光下通过肉眼进行观测，无需进行测序等复杂操作，可以有效克服现有技术的不足，大幅度缩短检测时间，更加简便快捷的检测出小檗皮主流品种以及成药中是否含有小檗皮，保证药材和成药的用药安全。

此外，在核酸扩增部分，传统的PCR扩增体系，通常在变性、退火、延伸3个温度点停留一定的时间来达到核酸分子扩增的目的；本发明创造性地省略掉3个温度点的停留时间，通过对扩增体系进行设计和优化，使得反应体系只需要在高低两个温度点之间进行往复升降温就可以保证扩增的顺利进行，由于省略掉3个温度点的停留时间，扩增时间会从原来的1小时以上缩短至20-30分钟，相对于传统的PCR扩增体系，我们将此方法命名为快速核酸扩增方法。

发明内容

为此，本发明提供一种藏药小檗皮的检测引物、检测试剂盒及检测方法，以解决现有检测耗时长，操作复杂等问题。

本发明上述方法是利用快速核酸扩增方法联合荧光可视化分析技术扩增4种小檗皮主流品种匙叶小檗、鲜黄小檗、甘肃小檗和刺红珠和成药中小檗皮的DNA。