[发明专利]一种检测柑橘黄龙病菌的方法

说明书

本发明提供了一种检测柑橘黄龙病菌的方法，属于基因工程技术领域。本发明提供的检测柑橘黄龙病菌的方法，包括如下步骤：以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白作为抗原，获得相应多克隆抗体，提取待测样本的蛋白，将待测样本的蛋白结合至固相载体上，利用所述多克隆抗体对固相载体上的蛋白进行检测，若是出现25kDa条带，则表明为HflC蛋白。本发明提供的方法能够进行活体柑橘黄龙病菌的检测，而且能够特异检测柑橘黄龙病菌HflC蛋白，可用于检测感染黄龙病菌柑橘组织中HflC蛋白的积累，也可用于检测HflC蛋白在转基因植物中的积累情况。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种能够检测柑橘黄龙病菌的方法。

背景技术

柑橘黄龙病是柑橘生产上最具毁灭性的一种病害，由韧皮部杆菌引起，对柑橘产业造成重大损失。黄龙病菌可以侵染所有柑橘属植物，其致病机制仍不清晰。为了制定有效的柑橘黄龙病防治措施，需要深入了解黄龙病菌的致病机理。黄龙病菌基因组中有86个蛋白含有Sec分泌信号肽。黄龙病菌中的部分Sec分泌系统转运效应蛋白(Sec-deliveredeffectors,SDEs)在柑橘中表达水平高于其在柑橘木虱中的表达水平，这些在柑橘中表达水平高的SDEs可能参与黄龙病菌入侵柑橘的过程。其中包括SDE1(CLIBASIA_05315)，SDE1通过和类papain半胱氨酸蛋白酶PLCP互作抑制柑橘的半胱氨酸蛋白酶活性，从而减弱柑橘对黄龙病菌的免疫反应。SDE15通过与ACD2互作抑制柑橘免疫反应，下调抗病相关基因如WRKY22，PR1等的表达水平，从而促进黄龙病菌侵染。本领域目前检测柑橘黄龙病菌的方法大多存在方法复杂、检测结果不准确等缺陷，而且并非是所有的蛋白都能作为制备抗体且能够成功检测活体病菌的抗原，本领域目前尚未公开过如何通过柑橘黄龙病菌HflC蛋白实现实时检测柑橘黄龙病菌发生发展动态规律的有关技术内容。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测柑橘黄龙病菌的方法，具有结果准确、方法简单、灵敏度高的优势。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测柑橘黄龙病菌的方法，包括如下步骤：以氨基酸序列如SEQID NO.1所示的蛋白作为抗原，获得相应抗体，提取待测样本的蛋白，将待测样本的蛋白结合至固相载体上，利用所述抗体对固相载体上的蛋白进行检测，若是出现25kDa条带，则表明为柑橘黄龙病菌。

优选的，编码权利要求1所述蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因插入质粒载体中，获得重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞后进行小量诱导表达和/或大量诱导表达，纯化浓缩后得所述抗原。

优选的，所述质粒载体包括pET-28a(+)。

优选的，获得相应抗体的步骤包括：将免疫佐剂和所述抗原溶液液等体积混和后，对体重2.4-2.6Kg的新西兰白兔进行免疫，第一次免疫抗原浓度为1mg/ml，每只兔子注射0.5ml，第二次免疫至第四次免疫抗原浓度为0.5mg/ml，每只兔子注射0.5ml。

优选的，第一次免疫采用完全佐剂，第二次免疫至第四次免疫采用不完全佐剂。

优选的，所述抗体为单克隆或多克隆抗体，所述固相载体包括PVDF膜。

优选的，将待测样本的蛋白结合至固相载体上时，所用的二抗为羊抗兔二抗。

本发明还提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白或核苷酸序列如SEQID NO.2所示的基因在检测植物柑橘黄龙病菌中的应用。

本发明还提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白或核苷酸序列如SEQID NO.2所示的基因在检测植物柑橘黄龙病菌HflC蛋白积累量中的应用。

本发明的有益效果：