[发明专利]耐蛋白酶水解的高稳定抗菌肽HW及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种耐蛋白酶水解的高稳定抗菌肽HW及其制备方法和应用，属于农业畜牧兽医应用领域，其序列如SEQ ID No.1所示；本发明通过合理的将脯氨酸P放置在精氨酸R旁边以保护精氨酸R免受蛋白酶的识别，引入不受蛋白酶识别的组氨酸H为高稳定抗菌肽额外提供正电荷，防止精氨酸R被过多水解导致抗菌肽的正电性不足而失活，制出一条高稳定抗菌肽HW。本发明的高稳定抗菌肽HW在胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶存在下对大肠杆菌具有高效抑菌活性，同时对人血红细胞没有毒性，使其具备成为饲用抗生素替代物的潜力。

技术领域

本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种耐蛋白酶水解的高稳定抗菌肽HW及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽是一种天然活性多肽，通常由10-30个氨基酸残基组成，具有广谱的抗菌活性。不同于抗生素通过干扰微生物关键代谢途径的抑菌机制，抗菌肽通常以物理破坏细菌膜的方式来杀灭致病微生物。因此，抗菌肽相比于抗生素不容易产生耐药性，是极具潜力的饲用抗生素替代产品。

近年来，抗菌肽的体外应用技术已经逐渐成熟，但体内可利用性较差，短期内仍然难以应用到畜牧生产中。饲粮中添加的抗菌肽在被动物采食后可长时间停留在胃肠道内，极易被胃肠道内的多种蛋白酶水解，分解成的小肽通常对病原体无显著抑菌活性。攻克抗菌肽蛋白酶稳定性差的技术瓶颈是解决抗菌肽应用到畜牧生产中最关键的环节。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于公开一种耐蛋白酶水解的高稳定抗菌肽HW，其目的是能够抵抗多种蛋白酶的水解并抑制大肠杆菌的生长，使其拥有成为饲用抗生素替代物的潜力。

本发明的目的是这样实现的：一种耐蛋白酶水解的高稳定抗菌肽HW，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,其C端酰胺化，N端乙酰化。

本发明的另一目的是提供一种耐蛋白酶水解的高稳定抗菌肽HW的制备方法，方法如下：以(RPW)₄为本抗菌肽的基本单元，其中精氨酸R用于提供吸附大肠杆菌的正电荷，色氨酸W用于提供杀灭病原体的疏水力，脯氨酸P侧链保护精氨酸R免受蛋白酶的识别，将RPW串联重复四次，其序列为RPWRPWRPWRPW；在肽链的两侧引入组氨酸H用于提供不受蛋白酶识别的正电荷；并将其C端酰胺化，N端乙酰化；采用固相化学合成法得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽，其序列如SEQ ID No.1所示，经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备；再经过含有多种蛋白酶的抗菌活性测定、溶血活性测定，最后命名为抗菌肽HW。

本发明的另一目的是提供一种耐蛋白酶水解的高稳定抗菌肽HW在制备治疗大肠杆菌感染性的疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果及优点如下：本发明合理的将脯氨酸P放置在精氨酸R旁边以保护精氨酸R免受蛋白酶的识别，引入不受蛋白酶识别的组氨酸H为高稳定抗菌肽额外提供正电荷，防止精氨酸R被过多水解导致抗菌肽的正电性不足而失活，成功创制一条能够抵抗多种蛋白酶水解的高稳定抗菌肽HW，并对其进行生物学活性检测，发现其在胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶存在下对大肠杆菌具有高效抑制活性，具备较低的溶血毒性，该高稳定抗菌肽在128μM的浓度下仅造成6.62％的红细胞溶血，其已具备成为饲用抗生素替代物的发展潜力。因此本发明是一种全新设计的耐蛋白酶水解抗菌肽，为饲用型抗菌肽的研发提供理论基础和技术支持。

附图说明

图1为本发明的高稳定抗菌肽HW的高效液相色谱图。

图2为本发明的高稳定抗菌肽HW的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱图。

图3为本发明的高稳定抗菌肽HW和蜂毒素ME的溶血活性图。

具体实施方式

下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明:

实施例1

高稳定抗菌肽HW的设计