[发明专利]一种可分泌表达具有天然活性抗菌肽的益生菌及质粒的构建方法

说明书

本发明公开了一种可分泌表达具有天然活性抗菌肽的益生菌及质粒的构建方法，质粒的构建包括制备pET‑YebF‑C27质粒；反向PCR制备线性化载体；连接线性化载体和同源重组片段，连接产物即为可分泌表达具有抗菌肽的质粒。益生菌的构建，包括：制备EcN1917菌株感受态细胞；制备含有重组质粒的益生菌；诱导表达得到可分泌表达具有天然活性抗菌肽的益生菌。本发明将抗菌肽cecropin‑BM编码基因与yebF基因融合并连接到pET‑HITES载体上，克隆入EcN1917中，借助双顺反子偶联翻译技术，使EcN1917分泌表达具有天然抗菌活性的抗菌肽。

技术领域

本发明涉及抗菌肽表达递送领域，具体涉及一种可分泌表达具有天然活性抗菌肽的益生菌及质粒的构建方法。

背景技术

随着广谱抗生素在人和动物中的广泛使用，细菌耐药性问题变得日益突出。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽，是生物体内先天免疫系统的重要组成部分，因其不易引起细菌耐药，被认为是传统抗生素的理想替代品。但抗菌肽本身存在稳定性差，半衰期短，易被蛋白酶降解等缺点，因此，开发针对抗菌肽的体内递送系统(delivery system)以提高抗菌肽的生物利用度和稳定性是多肽临床应用的关键。

目前已有多种关于抗菌肽体内递送系统的设计，所采用的策略主要有两种：(1)利用物理方法将抗菌肽封装于无机载体(如金、银和二氧化硅固体纳米颗粒)中；(2)利用化学方法将抗菌肽吸附于有机载体(如胶粒、脂质体和水凝胶)的表面。(Cheng Wang，TingtingHong，Pengfei Cui，等，Antimicrobial peptides towards clinical application:Delivery and formulation，Advanced Drug Delivery Reviews，2021,175,113818)。这些策略在理论和技术层面可行，但也存较多不足，主要包括：(1)在物理或化学处理过程中，抗菌肽发生变性或活性降低，导致疗效低下；(2)药物载量不稳定；(3)药物进入体内后提前释放或泄露；(4)载体材料的安全性不确实。因而，开发更有效、更稳定、更安全的抗菌肽体内递送系统势在必行。

益生菌(probiotics)是一类对宿主有益的细菌。2001年，世界卫生组织(WHO)将益生菌定义为活的微生物，当达到足够量时，对宿主健康有益。尼氏大肠杆菌1917(Escherichia coli strain Nissle 1917,EcN1917)是益生菌的一种，可以在肠道定植，在100余年前就开始用于治疗肠道疾病。由于其具有良好的安全性并易于进行基因操作，为同时实现外源蛋白表达和体内递送提供了一种理想的工具(Ainsworth C.Engineering themicrobiome.Nature.2020；577(7792):S20–S22)，具有广阔的应用前景。

很显然，以EcN1917作为抗菌肽表达和体内递送载体可克服基于无机或有机载体策略而设计的递送系统的种种缺陷和不足。然而，要利用EcN1917表达并递送抗菌肽就必须突破三方面的技术难题：

(1)抗菌肽不同于其他蛋白，其本身具有杀菌作用。为降低抗菌肽对宿主细胞的毒性，常规的表达策略是将抗菌肽与其他蛋白进行融合表达，融合表达产物以包涵体的形式存在，需经菌体裂解、目的蛋白提取纯化和酶切等多种技术处理后才能恢复抗菌肽的抗菌活性。基于这种策略构建的EcN1917基因工程菌显然不能实现递送有抗菌活性的抗菌肽的目的。

(2)要使EcN1917中表达的抗菌肽进入体内发挥抗菌活性，就必须进行分泌表达。常规的分泌表达策略是将一段信号肽序列嵌合到目的基因上游，使蛋白质的转运和定位序列得以整合到表达产物新生肽的N端序列上，它们与细胞膜或质膜的特异受体识别并结合，引导目的多肽分泌到细胞外周质或培养基中，分泌完成后，信号肽被工程菌中的信号肽酶切除。但信号肽的筛选费时费力，介导分泌的作用亦不理想。