[发明专利]一种可分泌表达具有天然活性抗菌肽的益生菌及质粒的构建方法

权利要求书

1.一种可分泌表达抗菌肽的质粒构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1.1)提取EcN1917细菌的基因组，EcN1917细菌的基因组作为模板，进行PCR反应扩增，纯化YebF基因，之后经限制性内切酶NheⅠ和限制性内切酶BamHⅠ双酶切后，连接至pET28-INF-cecropin-BM载体，得到pET28-YebF-INF-cecropin-BM质粒；

(1.2)反向PCR制备线性化载体：取pET-HITES质粒进行PCR扩增，经纯化后获得线性化载体；

(1.3)连接线性化载体和同源重组片段，连接产物即为可分泌表达具有抗菌肽的质粒。

2.根据权利要求1所述的可分泌表达抗菌肽的质粒构建方法，其特征在于，步骤(1.1)中，采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取EcN1917细菌基因组。

3.根据权利要求1所述的可分泌表达抗菌肽的质粒构建方法，其特征在于，步骤(1.1)中，PCR反应扩增采用P1和P2引物：

P1：5’-CTA-GCTAGCATGAAAAAAAGAGGGGCGTT-3’；

P2：5’-CGC-GGATCCACGCCGCTGATATTCCGCCA-3’。

4.根据权利要求1所述的可分泌表达抗菌肽的质粒构建方法，其特征在于，步骤(1.1)中，PCR反应扩增的反应程序为：

先在93～97℃预变性2～5min；

再在93～97℃变性10～30s，然后50～60℃退火10～30s，之后70～74℃延伸3～7s，采用变性、退火和延伸共进行25～35次循环；

最后在70～74℃延长3～7min。

5.根据权利要求1所述的可分泌表达抗菌肽的质粒构建方法，其特征在于，步骤(1.2)中，PCR扩增采用P3和P4引物：

P3：5’-GCGGCCGCTTAGTGCTAG-3’；

P4：5’-AATCCTGGCTCCTTCTTAAAGTT-3’。

6.根据权利要求1所述的可分泌表达抗菌肽的质粒构建方法，其特征在于，步骤(1.2)中，PCR扩增的反应程序为：

先在95～99℃预变性20～50s；

再后95～99℃变性5～20s，然后50～60℃退火2～10s，之后70～74℃延伸30～60s，采用变性、退火和延伸共进行25～35次循环；

最后70～74℃延长0.5～2min。

7.根据权利要求1所述的可分泌表达抗菌肽的质粒构建方法，其特征在于，步骤(1.3)中，PCR扩增采用P5和P6引物：

P5：5’-TTTAAGAAGGAGCCAGGATTATGGGCAGCAGCCATCATCA-3’；

P6：5’-CTCTAGCACTAAGCGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCT-3’。

8.根据权利要求1所述的可分泌表达抗菌肽的质粒构建方法，其特征在于，步骤(1.3)中，PCR扩增的反应程序为：

先在95～99℃预变性20～50s；

再后95～99℃变性5～20s，然后55～65℃退火2～10s，之后70～74℃延伸2～10s，采用变性、退火和延伸共进行25～35次循环；

最后70～74℃延长0.5～2min。