[发明专利]一种基于环境DNA技术对豹纹鳃棘鲈生物量监测的探针引物组和方法

权利要求书

1.一种基于环境DNA技术对豹纹鳃棘鲈生物量监测的引物探针组，其特征在于，包括引物Pl-F、Pl-R和探针Pl-P；

所述引物的序列为：

Pl-F：5’-GTCCTTTCGATGGGTGCTGT-3’，

Pl-R：5’-TGCTGTGTAGGGTGTAACCTGT-3’；

所述探针Pl-P的序列为：5’-TCGCCATTGTCGCTGCCTTCGTGCA-3’。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1修饰。

3.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物探针组。

4.权利要求1或2所述的引物探针组用于基于环境DNA技术对豹纹鳃棘鲈生物量监测的用途。

5.权利要求1或2所述的引物探针组在制备用于基于环境DNA技术对豹纹鳃棘鲈生物量监测的试剂盒中的用途。

6.一种基于环境DNA技术对豹纹鳃棘鲈生物量监测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以豹纹鳃棘鲈的基因组DNA为模板，PCR扩增权利要求1或2中所述引物对应的COI基因CDS片段全长；将PCR产物与克隆载体pUCm-T连接并扩大培养，提取质粒；计算质粒拷贝数并进行梯度稀释；以梯度稀释后的质粒为模板，利用权利要求1所述的引物探针组进行qPCR扩增，制作豹纹鳃棘鲈目的片段拷贝数与Cq值的标准曲线，并确定qPCR检测下限LOD；

(2)采集不同海域环境下的水体，利用过滤法收集并提取水体中的环境DNA，以水体环境DNA作为模板，使用权利要求1所述的引物探针组进行qPCR检测，记录Cq值；

(3)根据步骤(1)得到的豹纹鳃棘鲈COI基因CDS片段拷贝数与Cq值的标准曲线和qPCR检测下限LOD，以及步骤(2)得到的水体eDNA样品的Cq值，计算出水体中豹纹鳃棘鲈eDNA拷贝数；然后将水体中豹纹鳃棘鲈eDNA拷贝数与对应的豹纹鳃棘鲈COI基因CDS片段拷贝数与Cq值的标准曲线和qPCR检测下限LOD进行比较，据此判断豹纹鳃棘鲈的分布和存在情况。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，质粒梯度稀释后的目的片段拷贝数量级分别为10⁸copies/μL、10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增反应体系为：豹纹鳃棘鲈基因组DNA 1μL，blend taq 0.2μL，blend taq buffer 2μL，10μM正向引物Pl-F 0.5μL，10μM反向引物Pl-R 0.5μL，2mM dNTPs 2μL，ddH₂O 13.8μL，共20μL；PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec、58℃退火30sec、72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，qPCR扩增反应体系为：质粒DNA1μL，2×Taqman Fast qPCR Master Mix(Low Rox)10μL，10μM正向引物Pl-F 0.4μL，10μM反向引物Pl-R 0.4μL，10μM探针Pl-P 0.2μL，ddH₂O 8μL，共20μL；qPCR扩增反应条件为：94℃3min；94℃5sec，60℃30sec，40个循环。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，qPCR反应体系为：水体环境DNA 1μL，2×Taqman Fast qPCR Master Mix(Low Rox)10μL，10μM正向引物Pl-F 0.4μL，10μM反向引物Pl-R 0.4μL，10μM探针Pl-P 0.2μL，ddH₂O 8μL，共20μL；qPCR反应条件为：94℃3min；94℃5sec，60℃30sec，40个循环。