[发明专利]一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒。所述引物组合包括一组特异性等温扩增引物和一条gRNA序列。所述试剂盒包括：反应缓冲液；酶mix；引物探针mix。本发明还提供利用所述试剂盒检测鹦鹉热衣原体的方法，可对待测样本中脱氧核糖核苷酸进行等温扩增检测，检测方法对温控要求低，操作简单，可降低实验室设备要求；扩增和检测同步进行，整个反应30分钟内即可完成，检测结果特异性好、灵敏度高；整个实验过程无需开盖，极大降低实验室气溶胶污染风险。本发明所述试剂盒操作简单、特异性好、灵敏度高，在鹦鹉热衣原体检测方面具有重大临床意义。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒。

背景技术

鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)属于衣原体目、衣原体科、衣原体属中的一种革兰氏阴性、严格细胞内寄生的微生物，大小介于细菌和病毒之间，主要通过患病鸟类、禽类或吸入患病鸟类鼻腔分泌物的气溶胶和粪便或者羽毛的粉尘传播给人类。最初认为鹦鹉是该病原体的宿主，因而将其引起的疾病称为鹦鹉热。鹦鹉衣原体可在其众多宿主动物中引起广谱疾病，人类感染鹦鹉热通常表现为高热、恶寒、头痛、肌痛、咳嗽肺部浸润性病变等特征，潜伏期通常为5-14天，85％～90％患者出现肺炎，严重患者可并发心肌炎、心内膜炎、肺水肿等。

早期，由于各种检测方法还未发展起来，鹦鹉热衣原体的检测主要采用传染病病原诊断最基础的方法，即对病原体进行分离鉴定。实验室中，通常采用细胞接种培养、鸡胚接种培养和动物接种培养进行分离增殖，再通过染色和镜检进行检测是否为鹦鹉热衣原体。该方法试验时间久，操作过程繁琐，不适宜大规模的样本检测和流行病学调查。此外，免疫学检测技术也常用于实验室鹦鹉热衣原体检测，如免疫荧光技术、免疫血凝试验和酶联免疫吸附试验，此类方法敏感性高、特异性好，但也存在耗时长、成本高等缺点。

20世纪初，分子诊断技术利用标本中核酸作为检测对象，特异性高、灵敏度高、适应性强而被广泛应用。聚合酶链式反应(PCR)成为很多领域的实验室基本操作技术，荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入荧光基团，通过检测反应过程中的荧光信号，定性或定量的检测样本中病原体。2010年，冯悦等人建立Taqman—MGB荧光定量PCR检测方法，实验结果显示鹦鹉热衣原体菌株检测呈阳性，非鹦鹉热衣原体菌株检测呈阴性，证明该方法特异性良好，对鹦鹉热衣原体病的临床检查和流行病学调查都有重要意义。不过，相对于一般PCR而言，荧光PCR在应用上也有成本高，易污染等不足。

尽管PCR技术长期占据着核酸扩增技术的垄断地位，但等温扩增技术操作更简单、仪器要求低，正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。等温扩增技术和PCR技术都属于核酸扩增技术，与PCR技术相比，等温扩增技术不受温度循环限制，摆脱了对精密仪器的依赖，只需在某一特定的温度下实现核酸的扩增，避免了反复升降温的耗时过程，具有更高的灵敏度和扩增效率。

常见的等温扩增技术有环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA/RAA)和滚环扩增技术(RCA)等。LAMP目前应用最为广泛，专利CN113136445A公开了一种利用LAMP技术用于宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病的等温扩增检测试剂盒，扩增反应在30分钟内即可完成，但在产物检测方面，进行可视检测时需要高浓度SYBR Green I染料，因此无法实现闭管检测。专利CN114540525A用RAA技术扩增检测鹦鹉热衣原体，快速且高效，扩增反应在15分钟内完成，但扩增结束后，需要开盖使用侧流层析试纸条进行结果判读，亦无法闭管检测。因等温扩增技术扩增速度快，产物量大，扩增后，一旦开盖，极易产生气溶胶，影响后续其他样品的检测结果，产生假阳。等温扩增技术灵敏度高，但也会产生非特异性扩增，如采用常规的SYBR Green I或直观目测进行结果判读，无法区分非特异性扩增。