[发明专利]一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒

权利要求书

1.一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合，所述引物组合包括一组特异性等温扩增引物和一条gRNA序列；

所述特异性等温扩增引物包括以下序列的引物：

引物F3：5’-GCTGAGTTCCAATACGCT-3’；

引物B3：5’-CCTACTTGCCATTCATGGTAT-3’；

引物FIP：

5’-CCTCTTGGTTTGTGAATCACAAATTAATCCTAAGATTGAAATACTCAACG-3’；

引物BIP：

5’-AAGGAGCTAGCTCGAATTTTCCTTAATTGTAGCTGATTTGGTGTC-3’；

引物LB：5’-GTGCTGGGCTTGAAGTGA-3’；

引物LF：5’-CCTATAACGGCTGGAACAACAGAAG-3’；

所述的gRNA的序列为5’-AAUGUAGAUGGUUAGCACAAGCCCAGCACAAUUUGUGA-3’。

2.含有权利要求1所述的引物组合的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒。

3.如权利要求2所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括反应缓冲液、酶mix、引物探针mix；

所述引物探针mix即为所述引物组合，包括所述特异性等温扩增引物和所述gRNA序列；

所述反应缓冲液包括DNA荧光报告探针，核苷酸序列：

5’-FAM-TTTTTTTT-BHQ1-3’。

4.如权利要求3所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括质控品，所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品包括含有427bp片段的鹦鹉热衣原体OmpA基因的DNA质粒。

5.如权利要求4所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述427bp片段的鹦鹉热衣原体OmpA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。

6.如权利要求5所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述阳性质控品为含有SEQ ID NO.9所示的保守序列的质粒和提取后的人源细胞核酸的混合溶液；所述阴性质控品为提取后的人源细胞核酸。

7.如权利要求3所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述反应缓冲液包括dNTP、二甲基亚砜、氯化镁、氯化钾、山梨醇和DNA荧光报告探针；所述酶mix包括Bst DNA聚合酶和Cas12b核酸酶。

8.如权利要求3所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述反应缓冲液、酶mix、引物探针mix的组成如下：

反应缓冲液：20～100mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液，0.1～10μM dNTP，1～10mM DTT，0～25％v/v二甲基亚砜(DMSO)，2～50mM氯化镁，20～100mM氯化钾，0.01M～0.5M山梨醇，1～4μM DNA荧光报告探针；

酶mix：Cas12b蛋白1ng～10μg/反应，Bst DNA聚合酶1～100U/反应，20～100mMpH 7.5的Tris-HCl，1～10mM DTT(二硫苏糖醇)，20～50％v/v甘油；

引物探针mix：F3、B3引物各0.1～2μM；FIP、BIP引物各0.1～10μM；LF、LB引物各0.1～2μM；gRNA：100～300ng/反应。

9.利用如权利要求1～8之一所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒进行快速检测或辅助检测鹦鹉热衣原体的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的DNA核酸；

(2)以提取的DNA为模板，根据所述试剂盒组分，配制等温扩增反应体系，并以阳性质控品和阴性质控品为对照；

(3)进行等温扩增和检测，实时检测荧光信号，根据检测到的荧光信号值进行结果分析，判断样本中是否存在鹦鹉热衣原体。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述等温扩增反应体系为50μL，包括反应缓冲液30μL，引物探针mix 10μL，酶mix 5μL，模板DNA、阳性质控品或阴性质控品为5μL；

所述步骤(3)中，所述的等温扩增和检测程序为：65℃，每30s读取一次荧光值，时间30min；

所述步骤(3)中，所述结果分析方法为：荧光检测曲线呈上升趋势，30min的终点荧光信号值高于10000判定为鹦鹉热衣原体为阳性；荧光检测曲线呈水平状态，30min的终点荧光信号值低于10000判定为鹦鹉热衣原体为阴性。