[发明专利]一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体

说明书

本发明公开了一种D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体，属于酶工程技术领域。本发明所提供的高通量筛选方法是基于在酸性Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液中，D‑果糖可将黄色钼酸盐Mo(Ⅵ)还原，生成蓝色钼酸盐Mo(V/Ⅵ)，其颜色深浅在一定范围内与D‑果糖的含量成正比，且在相同浓度水平下，D‑阿洛酮糖不会干扰D‑果糖的测定。同时，本发明还提供了D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶四点突变体，与该酶野生型相比，其在60℃下孵育1h后的残余酶活提升69.8％，最适温度提高5℃，在60℃下的半衰期值由0.64h增加到7.30h，因此其工业应用潜力得到明显提升。

技术领域

本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，是当前研究最热的稀少糖。D-阿洛酮糖甜度约为蔗糖的70％，能量值却只有蔗糖的10％，是理想的蔗糖替代品。此外，D-阿洛酮糖具有多种优良的生理学功能，包括预防肥胖症、降低血糖、降低血脂、抗龋齿、抗氧化、治疗糖尿病和动脉粥样硬化疾病等。此外，在食品中添加D-阿洛酮糖还可以提高凝胶特性，并且通过美拉德反应改善食品的风味。目前，D-阿洛酮糖已被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为普遍公认安全类食品(GRAS)，并且FDA在2019年允许D-阿洛酮糖在食品标签中不计入总糖和添加糖含量。

D-阿洛酮糖可以通过化学法合成，但存在反应条件苛刻、产物分离困难、化学污染等问题。相对于化学合成，生物转化法具有反应条件温和、环境友好、高度特异性等优点，D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)能够催化D-果糖发生C-3位置的差向异构化反应，直接生成D-阿洛酮糖，是目前最为高效和常见的D-阿洛酮糖生产方法。

由于已报道的大多数DAEase热稳定性较差，难以满足工业实际应用的需求，国内外已开展针对DAEase热稳定性提升的分子改造研究，主要是基于蛋白融合技术和理性设计手段，包括温度因子(B-factor)分析、二硫键设计、亚基界面相互作用分析和计算机辅助折叠自由能(ΔΔG_Fold)计算等。

定向进化技术是酶功能强化的有效方法，但其在DAEase分子改造中的应用潜力还没有被充分挖掘，其主要瓶颈在于缺少快速高效的筛选方法。现有的DAEase高通量筛选方法，存在操作复杂、筛选成本高等问题。

发明内容

本发明利用D-果糖和D-阿洛酮糖在酸性Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液中还原能力的差异，建立了基于比色定量的高通量筛选方法，有效偶联DAEase突变体基因型与表型。本发明还提供了利用所述筛选方法，以来源于微生物Clostridium cellulolyticum的D-阿洛酮糖3-差向异构酶为亲本，经过多轮定向筛选获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶四点突变体，其热稳定性和酶活性都得到了增强。

本发明内容的目的是提供一种D阿洛酮糖3差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法以及热稳定性和酶活性增强的D-阿洛酮糖3-差向异构酶四点突变体、编码基因、重组载体和基因工程菌。

本发明采用的技术方案是：

本发明的第一个目的是提供一种基于比色定量的D阿洛酮糖3差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法，具体步骤如下：

1)以DAEase编码基因作为突变模板，基于易错PCR方法，使用低保真DNA聚合酶(rTaq，同时加入Mn²⁺(0.1mM)和Mg²⁺(6mM)产生和调节突变率，获得DAEase的随机突变文库，然后将待筛选的单菌落接种到96孔深孔板中，进行重组DAEase的诱导表达后得到发酵液；