[发明专利]一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体

权利要求书

1.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的第38位丝氨酸突变为苯丙氨酸，第42位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第70位丙氨酸突变为脯氨酸，同时将第119位苏氨酸突变为脯氨酸得到的。

2.权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为基于比色定量的高通量筛选方法，包括以下步骤：

(1)以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因为突变模板，通过易错PCR方法构建DAEase的随机突变文库；然后将待筛选的单菌落接种到96孔深孔板中，进行重组DAEase的诱导表达后得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液离心获取菌体沉淀，然后加入裂解液破碎细胞，将破碎后的细胞液离心取上清作为粗酶液，经60℃热处理后进行酶反应；所述酶反应为，将所述粗酶液添加至含有D-果糖的反应体系中，催化D果糖生成D阿洛酮糖；

(3)酶反应结束后，加入Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液，在70℃下加热显色，冷却至室温后，于750nm波长下测定吸光度值；将野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的平均酶活设为相对酶活100％，认定相对酶活大于120％的突变体为正向突变体；筛选得到权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体。

3.编码权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pET28a质粒为表达载体。

6.表达权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，或携带权利要求3所述基因，或携带权利要求3或4所述重组载体的重组细胞。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。

8.一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的第38位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，第42位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第70位的丙氨酸突变为脯氨酸，同时将第119位的苏氨酸突变为脯氨酸。

9.一种制备阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的突变体或权利要求6或7所述的重组细胞，以D果糖为底物，反应制备得到阿洛酮糖。

10.权利要求1所述的突变体或权利要求6或7所述的重组细胞在制备阿洛酮糖或含有阿洛酮糖的产品中的应用。