[发明专利]一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种D‑2‑羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统，涉及合成生物学，基因治疗和细胞免疫技术领域，所述控制系统的感应对象为D‑2‑羟基戊二酸，分为高浓度D‑2‑羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统HGind‑H和低浓度D‑2‑羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统HGind‑L；所述控制系统包括重组转录抑制子、D‑2‑羟基戊二酸诱导型启动子和待转录序列；本发明利用该系统控制响应肿瘤代谢物D‑2‑HG的诊断基因路线、自杀基因路线和免疫细胞治疗性基因路线，从而开发出以D‑2‑HG为关键信息的活细胞传感器、自杀基因治疗产品和细胞治疗产品。

技术领域

本发明涉及合成生物学，基因治疗和细胞免疫技术领域，具体说是一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统及其构建方法和应用。

背景技术

近年来发现D-2-羟基戊二酸(D-2-HG)是一种肿瘤代谢物，异柠檬酸脱氢酶IDH突变存在于多种肿瘤细胞中，是三羧酸循环关键酶，原功能为将异柠檬酸转变为2-酮基戊二酸(2-KG)，但突变可导致该酶产生强烈的催化2-KG还原生成D-2-HG的活力，造成胞内和肿瘤微环境D-2-HG的积累，因此D-2-HG这种代谢物是未来开发治疗肿瘤策略和药物的重要切入点。例如，可以工程化改造T细胞，使其感应D-2-羟基戊二酸浓度从而发挥抗肿瘤功能；可以探索感应D-2-羟基戊二酸的自杀基因线路，使肿瘤细胞特异性自杀。

D-2-HG作为IDH替代标志物，在区分胶质瘤、急性髓性白血病等肿瘤IDH突变中展现出较大应用价值，早期诊断及灵敏监测复发/转移是有效治疗肿瘤的关键。但是目前IDH检测方法面临着以下问题：早期瘤体产生标志物较少；标志物从微环境进入循环系统的转运限制、巨量稀释及快速排出等。体内应用的化学分子探针依靠被动扩散作用较难精准地到达肿瘤部位。基于工程化细胞的“活”的传感器，不仅能在体外检测D-2-HG的浓度，还能够在体内主动迁移到肿瘤、感应肿瘤信息并放大信号，代表了一种新兴的高敏感性肿瘤诊断技术。例如有研究者改造巨噬细胞，通过精氨酸酶-1的启动子驱动荧光素酶表达的基因，这些工程化巨噬细胞注入体内后迁移到肿瘤部位，激活产生荧光素酶；能够检测25-50mm³的肿瘤，敏感性高于临床上所用的蛋白及核酸标志物检测方法。CAR-T等工程化免疫细胞药物的成功，为未来活细胞的临床应用打开了道路。微环境中积累的D-2-HG作为IDH突变肿瘤的特异性信息，是这种“活”传感器的理想感应对象。

因此，目前亟需研发以D-2-HG为信息的治疗产品或细胞传感器，将不同生物的功能元件进行有效设计、优化和组装，对细胞进行定向改造，使其特定的功能满足特定需求。

发明内容

为解决目前通过感应肿瘤代谢物D-2-羟基戊二酸的产品无法满足特定需求的问题，本发明的目的是提供一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统及其构建方法和应用。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统，感应对象为D-2-羟基戊二酸，分为高浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统HGind-H和低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统HGind-L；所述控制系统包括重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型启动子和待转录序列；

所述高浓度为大于0.5mmol/L，所述低浓度为小于等于0.5mmol/L。

优选的，所述重组转录抑制子由转录抑制蛋白KRAB、感应D-2-HG的细菌转录阻遏调控因子DhdR和核定位信号NLS融合得到；

所述转录抑制蛋白KRAB为大鼠锌指结构蛋白Kid-1，序列为SEQ ID NO.1，或人锌指结构蛋白ZNF10，序列为SEQ ID NO.2；

所述感应D-2-HG的细菌转录阻遏调控因子DhdR为响应D-2-羟基戊二酸的细菌转录阻遏调控蛋白，应满足以下特征：