[发明专利]一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统，其特征在于：所述控制系统的感应对象为D-2-羟基戊二酸，分为高浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统HGind-H和低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统HGind-L；所述控制系统包括重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型启动子和待转录序列；

所述高浓度为大于0.5mmol/L，所述低浓度为小于等于0.5mmol/L。

2.根据权利要求1所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统，其特征在于：所述重组转录抑制子由转录抑制蛋白KRAB、感应D-2-HG的细菌转录阻遏调控因子DhdR和核定位信号NLS融合得到；

所述转录抑制蛋白KRAB为大鼠锌指结构蛋白Kid-1，序列为SEQ ID NO.1，或人锌指结构蛋白ZNF10，序列为SEQ ID NO.2；

所述感应D-2-HG的细菌转录阻遏调控因子DhdR为响应D-2-羟基戊二酸的细菌转录阻遏调控蛋白，应满足以下特征：

具有DNA结合结构域和配体结合结构域，在细菌中，结合在DhdR蛋白特异结合的DNA序列DhdO上阻止目标基因转录，结合D-2-羟基戊二酸后与DhdO脱离，从而使目标基因转录，DhdR和DhdO组成了细菌D-2-羟基戊二酸操纵子；

所述核定位信号NLS为引导蛋白质进入细胞核的结构域，氨基酸序列为PKKKRKV。

3.根据权利要求1所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统，其特征在于：所述D-2-羟基戊二酸诱导型启动子由组成型启动子Pc和DhdR蛋白特异结合的DNA序列DhdO串联组成，DhdO位于Pc的上游或/及下游；简称为DhdO(n₁)-Pc-DhdO(n₂)，其中n₁和n₂为DhdO的串联重复个数，0≤n₁≤14，0≤n₂≤14，且n₁和n₂不同时为0；

Pc为在真核细胞中组成型表达的启动子，包括但不限于为CMV、hPGK、mPGK或EF1α。

4.根据权利要求1所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统，其特征在于：所述待转录序列包括但不限于分泌性碱性磷酸酶、Gaussia荧光素酶、萤火虫荧光素酶、增强型荧光蛋白、嵌合抗原受体、细胞因子、趋化因子、自杀基因或D-2-羟基戊二酸分解代谢酶。

5.根据权利要求1所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统，其特征在于：当控制系统为低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统HGind-L时，所述控制系统还包括D-2-羟基戊二酸转运蛋白；

所述D-2-羟基戊二酸转运蛋白为SLC13A3蛋白，且SLC13A3蛋白由弱启动子或最小启动子驱动表达；

所述弱启动子或最小启动子包括但不限于minimal CMV promoter、mini-TK promoter或CMV53。

6.权利要求1～4所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

①设计并合成D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统，由重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型启动子和待转录序列组成；

②制备携带D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统的载体，所述载体为真核质粒表达载体、病毒颗粒或转染试剂；

③载体携带D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统进入目的细胞，所述目的细胞为细胞系或者原代细胞，所述原代细胞包括但不限于肿瘤细胞或免疫细胞；

④目的细胞感受D-2-羟基戊二酸浓度从而诱导转基因表达。

7.根据权利要求6所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统的构建方法，其特征在于：当控制系统为低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统HGind-L时，步骤①中在设计并合成D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制系统时，还需要加入D-2-羟基戊二酸转运蛋白。