[发明专利]一种精准分析单细胞APA位点的sc3T-seq方法

说明书

本发明公开了一种精准分析单细胞APA位点的sc3T‑seq方法，涉及分子生物学和生物信息学领域，oligo(dT)20引物与链霉亲和素的磁珠孵育结合，加入少量起始样本和外源单链DNA，双链cDNA合成，双链cDNA断裂，移除polyA，释放带标签的cDNA，加入具有生物素标记的λ‑DNA，加入羧基磁珠，筛选去除外源cDNA，末端修复、加接头、构建cDNA文库，链霉素亲和磁珠去除生物素标记λDNA，得到纯净的样本文库。本发明降低了起始样品量，使分析APA位点的实验技术能够适用于少量样本甚至单个细胞，对于精准检测、分析细胞特异性的APA有很大的作用。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物信息学领域，尤其涉及一种全基因组范围精准分析单细胞APA位点的sc3T-seq方法。

背景技术

APA是转录后调控的重要事件之一，参与了多种癌症基因表达的基本调节机制。不同癌细胞系中3'UTR亚型的差异表达表明APA与癌症之间有很强的联系。APA事件改变mRNA编码序列或3'UTR长度，直接或间接的影响一系列重要的生物过程，包括胚胎发育、细胞增殖分化、免疫响应、神经元激活及肿瘤发生等。研究发现APA具有组织特异性、细胞类型特异性，同时也受环境因素的影响(Chen,W.,et al.；Gruber,A.J.and M.Zavolan.)。

随着公共数据库中基因表达数据的不断完善与积累，通过对表达的序列标签(expressed sequence tags，ESTs)的生物信息学分析，APA全基因组范围的分析得以实现。整体APA变化也可以通过芯片法和双端双标签(paired-end ditag,PET)分析得到。随着高通量测序技术的发展及生物信息学的进步，通过RNA-seq对序列中的APA进行分析。然而针对APA的研究，只有覆盖至mRNA的3'端的reads才是有用的，这些仅占RNA-seq数据中的小部分，RNA-seq在基因的5'端和3'端的覆盖度相对整体而言较低，故RNA-seq不适合精确、广泛地确定多聚腺苷酸化位点。

研究发现富集3'端的RNA测序(3'-enriched RNA-seq)相对于标准的RNA-seq方法而言可以更好地识别多聚腺苷酸化位点，同时对拥有不同长度的3'UTR的mRNA更好地定量。虽然这些技术都能很好的捕获mRNA的3'端，但是大部分技术在构建文库时都很难避开PolyA结构对测序的影响，比如PAS-seq、Poly(A)-seq等。徐安龙(Fu,Y.,et al.)等创立了SAPAS技术，在PCR时引物部分引入人工突变，在Poly T序列中参入碱基C，以此减少高通量测序时Poly结构引起的测序信号混乱。然而，此方法也有它的局限性，比如加热断裂RNA的同时也会损伤PolyA结构、导致部分RNA丢失等。

Calvin H.Jan等(Jan CH.,et al.)人创立的基于oligo dT的方法，Poly(A)Position Profilingby sequencing(3P-seq)，在RNA阶段构建出3'UTR的标签文库，再经过逆转录后测序，确定文库标签来源是RNA，彻底避免Internal Priming问题。但是，该方法整个构建文库过程繁杂，而且大部分实验流程是在RNA水平操作，对实验条件和实验技术要求较高。经过多步的RNA连接和酶切，对RNA的损耗也较大，不适用于少量样品文库的构建。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种起始样品量极低的、精准分析单细胞APA位点的3T-seq方法，使该实验技术能够适用于少量样本甚至单个细胞。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何降低起始样品量，开发一种起始样品量极低的、精准分析单细胞APA位点的3T-seq方法，使该实验技术能够适用于少量样本甚至单个细胞。

为实现上述目的，本发明提供了一种精准分析单细胞APA位点的sc3T-seq方法，包括以下步骤：