[发明专利]一种精准分析单细胞APA位点的sc3T-seq方法

权利要求书

1.一种精准分析单细胞APA位点的sc3T-seq方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、磁珠与引物探针结合制备GsuⅠ-Oligo(dT)20磁珠；设计并合成一种外源单链DNA片段或者带有poly A的单链RNA，加入样本中，再加至制备好的所述GsuⅠ-Oligo(dT)20磁珠中，mRNA逆转录合成第一链cDNA；

步骤2、将配置好的二链合成体系与重悬好的步骤1得到的第一链cDNA进行合成反应，合成第二链cDNA，得到双链cDNA；

步骤3、片段化酶反应体系重悬步骤2得到的双链cDNA，置于冰上5min后加入5μL双链DNA片段化酶NEB，进行片段化反应，随机断裂新合成的所述双链cDNA，得到断裂后的cDNA；

步骤4、将配制好的消化反应体系加至装有步骤3得到的断裂后的cDNA的离心管中将其重悬，进行酶切反应，3'UTR末端从所述GsuⅠ-Oligo(dT)20磁珠上释放得到3'端标签原始文库；

步骤5、将步骤4得到的3'端标签原始文库中加入外源λDNA，纯化所述cDNA片段并去除所述外源单链DNA片段得到DNA标签文库；

步骤6、将步骤5得到的DNA标签文库末端修复得到末端修饰后的DNA，将所述末端修饰后的DNA的3’末端加A尾，与illumina公司高通量测序接头连接、高保真酶的PCR放大以及文库片段筛选，建库完成后，除去生物素标记的λ-DNA、纯化体系，得到无外源DNA污染的文库。

2.如权利要求1所述的sc3T-seq方法，其特征在于，所述引物探针的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

3.如权利要求1所述的sc3T-seq方法，其特征在于，所述步骤1中所述外源单链DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求1所述的sc3T-seq方法，其特征在于，所述步骤2中所述二链合成体系的组分为：30μL洗剂1，184μL无酶水，25μL 10×二链合成缓冲液，5μL10mM的dNTP(+dUTP，-dTTP)，1μL DNA连接酶，4μL DNA聚合酶，1μL核糖核酸酶H；其中所述洗剂1的组分为：280μL无酶水，80μL 5×一链合成缓冲液，40μL 0.1M的二硫苏糖醇。

5.如权利要求1所述的sc3T-seq方法，其特征在于，所述步骤2还包括：取含有50μg的无核糖核酸酶的所述外源单链DNA片段和单细胞混匀，于-80℃速冻2h以上，然后70℃恒温金属浴上加热变性3min，立即置于冰上冷却放置1min。

6.如权利要求1所述的sc3T-seq方法，其特征在于，所述步骤3中所述片段化酶反应体系的组分为：水39.5μL，10×片段酶反应缓冲液5μL，100×牛血清白蛋白0.5μL，配套的断裂酶5μL。

7.如权利要求1所述的sc3T-seq方法，其特征在于，所述步骤3中所述片段化反应温度为37℃，反应时间为22min。

8.如权利要求1所述的sc3T-seq方法，其特征在于，所述步骤4中所述消化反应体系的组分为：10×buffer B 10μL，0.5mmol/L S-腺苷甲硫氨酸2μL，GsuⅠ2μL，双蒸水86μL；其中所述buffer B为GsuⅠ配套的缓冲液，所述GsuⅠ的浓度为5U/L。

9.如权利要求1所述的sc3T-seq方法，其特征在于，所述步骤5中加入所述外源λDNA的质量为100ng；使用0.9x的磁珠去除所述外源单链DNA片段。

10.如权利要求1所述的sc3T-seq方法，其特征在于，所述步骤6中使用链霉素磁珠除去所述生物素标记的λ-DNA。