[发明专利]3α-类固醇脱氢酶的制备方法和应用

说明书

本申请公开了一种3α‑类固醇脱氢酶的制备方法和应用。本申请中本发明提供了基于原核表达体系的3α‑类固醇脱氢酶表达方法，该方法通过来源筛选结合同义密码子偏好性优化，使可溶蛋白表达量提高，并且维持了较高的表达产物活性，适宜工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及3α-类固醇脱氢酶的制备方法和应用。

背景技术

3α-类固醇脱氢酶(3α-hydroxysteroid dehydrogenase,3α-HSD)是睾丸丛毛假单胞菌分泌的一种类固醇脱氢酶,作用于多种基质,可逆地催化C19-27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原。临床上用3α-HSD检测人血清中的总胆汁酸(Total Bile Acids,TBA)。胆汁酸是胆汁的重要成分，主要存在于肠肝循环系统，在脂肪代谢中起着重要作用，只有一少部分胆汁酸进入外围循环，促进胆囊收缩和小肠的推进蠕动。血清总胆汁酸可敏感的反映是否存在肝细胞的病变，肝功能是否有损伤。升高多见于各种急慢性肝炎、乙肝病毒携带者、酒精性肝炎等疾病，另外，还可见于肝硬化、阻塞性黄疸、胆汁淤积性黄疸等疾病。在疾病诊断中TBA是也是唯一可同时反应肝脏分泌的状态、合成提取、肝细胞损害的三个方面的血清指标。

目前，酶循环测定法检测血清胆汁含量，操作简单、成本低、灵敏度高、反应产物无污染、抗干扰能力强，适用于常规检查。根据酶循环法测血清胆汁检查原理，3α-类固醇脱氢酶是重要的反应物。胆汁酸经3α-类固醇脱氢酶和硫代氧化型辅酶I(Thio-NAD)特异性氧化，生成3-酮类固醇和硫代还原型辅酶I(Thio-NADH)。3-酮类固醇在3α-HSD和还原型辅酶I(NADH)作用下，形成胆汁酸和氧化性辅酶I(NAD)。胆汁酸在多次循环的过程中被放大，同时生成的Thio-NADH扩增。测定Thio-NADH在405nm处吸光度的变化，可计算总胆汁酸含量。

然而，天然3α-HSD提取工艺复杂，提取物杂质多，需要经过多步层析和制备性等电聚焦电泳技术来纯化，步骤繁琐、得率低，纯化工艺中伴随酶活性丢失，更为重要的是3α-HSD与β-HSD难以分离，得到的3α-HSD价格昂贵，限制了大范围临床检测的应用。因此，尚需开发一种基因工程表达3α-类固醇脱氢酶的方法，以实现稳定的大规模制备3α-类固醇脱氢酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种3α-类固醇脱氢酶的制备方法。

本发明的另一目的在于提供编码3α-类固醇脱氢酶的多核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供与编码3α-类固醇脱氢酶的多核苷酸序列适配的载体。

本发明的另一目的在于提供含有编码3α-类固醇脱氢酶的多核苷酸序列的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供了一种编码3α-类固醇脱氢酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示序列的多核苷酸；

(ii)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

(iii)与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。

本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者

所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的多核苷酸。