[发明专利]一种羊源性基因组DNA的提取方法、试剂盒和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羊源性基因组DNA的提取方法、试剂盒和应用。本申请尝试在蛋白酶K法的基础上，向裂解液的组成成分中添加了一种化学螯合树脂Chelex‑100，同时与上述几种常用的DNA提取方法进行比较，筛选得到了高质量羊源性基因组DNA的提取方法。采用本申请方法可以在进行大量提取时保证DNA质量，且提取的DNA可作为羊源性成分检测中的DNA模板，具有适宜实验的浓度和纯度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羊源性基因组DNA的提取方法、试剂盒和应用。

背景技术

正所谓“民以食为天”，食品安全是世界公共卫生问题中非常关键的一部分。人类生存的必要条件就是食品。蛋白质是维持人体健康的必须物质，而肉类食品中富含蛋白质和微量元素，故在食品消费中占比很大。近些年来，随着社会经济水平的不断提高，肉制食品的需求也不断提高，很多商贩为获取更多收益而出现了违法行为，将价格较低的肉类夹杂进牛羊肉后再以高价售出。这极大的影响了食品的安全问题。

分析测试技术发展日新月异，从传统物理方法到核酸检测鉴定，肉类制品掺假的检测能力也逐渐提高。传统的物理方法是通过显微镜观察肉类样品的颗粒形态学构造来区分不同动物组织，该方法出现假阳性较少，热稳定性较为理想，不过主观因素影响较为严重，分辨力也无法保证，且无法区分动物种类^[1]。近年来，以特征蛋白质和核酸为目标物的肉类掺假检测技术逐渐兴起^[2-5]，利用免疫学方法可以定量测定动物源成分，其中微孔板ELISA在定量上的精确度较高^[6-7]。胡连霞^[8]等人开发了实时荧光PCR检测法对添加4类假肉的样品进行同时检测，与其他检测方法相比时间更短，能够实现快速检测。Qiang Wang等^[9]基于数字PCR技术，建立了一种高精度的肉制品中山羊和绵羊含量定量分析方法(Mgoat＝Nⅹ0.0019ⅹC-3.35；Msheep＝Nⅹ0.0017ⅹC+2.08)，山羊和绵羊成分检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为1拷贝/μL和5拷贝/μL。与其他检测方法对比来看需要的时间更少，能够实现快速检测。因此，本文将分别从光谱技术，免疫学技术和核酸检测技术等角度，针对肉类和肉类制品中具有的动物源性成分检测方法以及鉴别技术展开分析和阐述，对多种方式的优势和劣势对比分析，旨在为进一步的研究和标准制定提供参考。

一、市场上常见的掺假形式

羊肉含丰富的营养，味道鲜美，因此消费者对羊肉特别钟爱。但近年来，很多商贩为获取更多收益将价格较低的鸭肉和猪肉掺杂进牛羊肉后以高价售出，影响肉类市场的流通和消费者的健康。按照掺假严重性对肉类掺假进行分类，共有三种^[11]。第一类是将低价肉类如鸭肉等加入到牛羊肉中再以高价出售，这种掺假方式在生活中最为常见也最为严重。且羊肉制品多是在涮火锅时食用，通过添加各种调味剂，在很大程度上掩盖了羊肉原有的味道，这也使得消费者难以简单的从感官上进行辨别。第二种是利用一些如马肉、狐狸肉以及水貂肉等非可食用的肉类进行掺假。鉴于这些肉类大多是由与皮毛生产有关的养殖场提供的，在动物饲养过程中往往无节制的使用药物，因此这类肉制品中存在很大的安全隐患。第三种是利用来源不明确的非可食用肉类在羊肉中进行掺假，常见的有：流浪的猫肉，狗肉以及老鼠肉等未经过正规的食品安全检测的肉类，此类掺假方式多见于流动商贩，因其没有固定场所，无法追踪，而且食用这些肉制品后极易感染疫病，故其行为也是最为恶劣的。

二、基于光谱法的鉴别方法

拉曼光谱法

这种方法是通过物质分子光散射作用下非破坏指纹成像技术，对各种照射光的频率进行散射光谱研究，能够获取分子转动与振动的相关数据，可利用其完成分子结构的分析。Fowler等^[12]指出拉曼光谱技术之所以可以运用在食品成分检测中，是因为它可以对食品中的主要成分含量和结构进行分析，既可定性检测物质的分子结构又可定量的检测某种成分的含量。拉曼光谱法的优点在于重复性能好、灵敏且应用很简单等^[13-14]。