[发明专利]高产ε-聚赖氨酸的多基因过表达链霉菌工程菌株及方法与应用

说明书

本发明公开了一种同时过表达二氨基庚二酸酯差向异构酶基因dapF和二氨基庚二酸酯脱羧酶基因lysA的高产ε‑聚赖氨酸的链霉菌工程菌株构建方法及其应用。高产链霉菌工程菌株ε‑聚赖氨酸的产量(g/L)为出发底盘菌株S.diastatochromogenes6#‑7的154.99％；生产强度(g/L·h)为出发底盘菌株S.diastatochromogenes6#‑7的160.45％；糖酸转化率分别为出发底盘菌株S.diastatochromogenes6#‑7的143.94％，显著降低了生产成本，为ε‑聚赖氨酸的工业生产提供了优良菌株。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种构建多基因过表达淀粉酶产色链霉菌菌株、方法及提高ε-聚赖氨酸产量的方法与应用。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-Polylysine，简称ε-PL)是天然的生物防腐剂，一般有25～35个L-赖氨酸残基的ε-氨基和α-羧基相连而成，有着水溶性好、pH、热稳定性强、抑菌图谱广、可生物降解等优势，除了在食品领域的应用，在材料、生物医药等领域也有广泛的应用前景。

从第一株产ε-PL菌株的发现至今，ε-PL生产菌株的选育仍有较大的提升空间，目前菌株的选育多从诱变育种和基因工程育种两方面开展。关于利用基因工程的手段强化多个基因表达量构建工程菌株提高ε-PL的产量的研究相对较少，尤其是未见通过过表达多个DAP途径中关键酶基因的相关报道。

通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的公开文献：

1.一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用(CN 105441373 B)，公开了一种小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD-4，它是将来源于S.albulus PD-1基因组上的铵转运蛋白基因amtB进行过量表达，具有比白色链霉菌S.albulus PD-1(CCTCCM2011043)更高的ε-PL合成能力。虽然工程菌的ε-聚赖氨酸合成效率有所提高，但ε-PL合成的代谢途径并未强化，小白链霉菌ε-PL产量仍有提升空间。

2.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法(CN111471633 A)公布了一株淀粉酶产色链霉菌CATF，它是将淀粉酶产色链霉菌TUST的乙酰辅酶A乙酰转移酶基因(catF)进行过表达处理，较出发菌株ε-聚赖氨酸生产能力提高27.91％。表明了该基因对ε-聚赖氨酸生产能力提高具有重要作用，但只过量表达了单个基因，ε-PL生产水平仍有提升空间。

3.WangAixia等使用kasOp*强启动子和噬菌体衣壳蛋白的核糖体结合位点，在链霉菌CICC11022中过表达ε-聚赖氨酸合酶基因pls，协同外源添加柠檬酸钠使ε-聚赖氨酸的效价提高88.2％(Frontiers in Bioengineering andBiotechnology，2020，8.288)。

4.毛忠贵等在高产菌株S.albulus SS-62和其亲本菌株S.albulus M-Z18之间进行了蛋白质组学分析，结果表明参与ε-聚赖氨酸前体代谢和能量代谢的蛋白质的表达水平以及与转录调控和翻译相关通路中的蛋白质表达水平均被上调，qRT-PCR验证发现基因pls、frr、hrdD表达提高，分别过表达基因pls和frr使ε-聚赖氨酸的效价和单位细胞产率得到了少量提高，但效果并不显著(RSC Advances，2019，9(42)：24092-24104)。

目前虽然有报道将基因工程技术用于ε-聚赖氨酸生产菌株的改造上，但大部分只局限于代谢通路上单一基因的改造，且部分基因的过表达效果并不理想，因此如何通过过表达多个基因进一步提高ε-聚赖氨酸及其盐酸盐生产水平仍是目前迫切需要解决的关键技术难题。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种多基因过表达链霉菌工程菌株及构建方法与应用。