[发明专利]基因编辑细胞脱靶检测的方法

权利要求书

1.一种基因编辑细胞脱靶检测的方法，其特征在于，包括：

(1)对细胞进行基因编辑，获得的基因编辑细胞中含有蛋白-单链DNA复合物；

(2)从所述基因编辑细胞中分离出单链DNA；

(3)将所述单链DNA构建测序文库，对所述测序文库进行测序，获得测序结果；

(4)将所述测序结果与参考序列进行比对分析，确定脱靶信息。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白选自复制蛋白A、RAD51蛋白或ATRIP蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑细胞选自细胞系、原代细胞、免疫细胞、干细胞、体细胞或生殖细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑采用的基因编辑工具包括：TALEN、ZFN或者CRISPR系统介导的基因编辑器。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因编辑器选自CRISPR/Cas9基因编辑器、单碱基编辑器或者先导编辑器。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：将预先构建的用于基因编辑的载体转染至细胞中，培养细胞至预定时间后进行步骤(2)；

其中，当采用CRISPR/Cas9基因编辑器进行基因编辑时，所述预定时间为48～96小时；

当采用单碱基编辑器或者先导编辑器进行基因编辑时，所述预定时间为12～48小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：

将含有所述基因编辑细胞的细胞液与刀豆蛋白A磁珠共孵育，去除上清，用含有所述蛋白的抗体的缓冲液重悬磁珠，孵育，洗涤磁珠；

用含有pA-MNase的洗涤缓冲液重悬磁珠，孵育，洗涤磁珠；

用含有EDTA的缓冲液重悬磁珠，孵育，向试管中加入CaCl₂溶液重悬磁珠，冰上消化，终止反应，离心，置于磁力架上，收集上清液；

将所述上清液、蛋白酶K和载体RNA进行反应，得到反应液；

从所述反应液中分离出单链DNA。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重悬磁珠时，通过敲击试管以混匀。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤(2)分离出的单链DNA进行步骤(3)的构建测序文库之前，采用HL-dsDNase处理所述单链DNA，将所得处理物进行步骤(3)。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，基于500个至100万个所述细胞获取的单链DNA，所述HL-dsDNase的用量为1～5μL；

所述处理包括：35～39℃孵育50分钟～70分钟，70～80℃孵育15～25分钟。

11.一种构建脱靶预测模型的方法，其特征在于，包括：

针对细胞进行基因编辑，得到基因编辑细胞；

利用权利要求1～10任一项所述基因编辑细胞脱靶检测的方法对所述基因编辑细胞进行不同基因编辑工具的脱靶检测，得到脱靶信息；

将所述脱靶信息以及所述细胞的信息进行训练和测试，得到不同基因编辑工具针对所述细胞的脱靶预测模型。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞的信息包括下列至少之一：细胞的类型、基因组信息、表观组学信息和转录组学信息。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述表观组学信息包括下列至少之一：染色质开放性信息、不同组蛋白修饰信息、甲基化信息和CTCF结合位点。