[发明专利]一种快速检测TREC拷贝数的引物探针组、试剂盒及其应用

说明书

本发明属于生物工程和基因检测领域，具体涉及一种用于检测TREC拷贝数的引物探针组、试剂盒及其应用，本发明试剂盒包括检测内参基因ALB、TCRA基因Jα58区域和Jα61区域的Taqman荧光探针和引物，用于对TREC进行定量的标准品，标准品包括具有浓度梯度的人类基因组DNA、含有Jα58区域的质粒和含有Jα61区域的质粒。本发明试剂盒通过对TREC的Jα61区域和Jα58区域均进行检测，具有检测灵敏度高、可定量等优势，避免假阳性的风险，具有较高的检测准确度和时效性，并且本发明试剂盒采样方便、采血量极少且检测费用低，具有极高的推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程、基因检测领域，具体涉及一种快速检测TREC拷贝数的引物探针组、试剂盒及其应用。

背景技术

原发性免疫缺陷病(Primary Immunodeficiency Disease,PID)是一类由基因缺陷导致的免疫系统损伤性疾病，多数为单基因遗传性疾病，大部分患儿在年幼时发生反复严重感染甚至死亡。重症联合免疫缺陷病(Severe Combined Immunodeficiency，SCID)是一类最严重的PID，绝大部分病人在无治疗情况下1岁以内死亡。临床治疗通过造血干细胞移植可以重造PID患儿的免疫系统，从而有效改善PID患儿的生活质量。然而，研究表明造血干细胞移植的时机不但对其成功率有重要影响，还影响到所产生的费用，如：小于3.5个月的SCID患儿造血干细胞移植存活率为94％，显著高于年长或继发感染的患儿；小于3月龄的SCID患者进行造血干细胞移植的医疗花费是大于3月龄的SCID患者的1/2。因此，PID患者的早期诊断及治疗不仅可以改善患者的预后，同时可显著减轻家庭及社会经济负担。

目前PID识别主要通过阳性家族史或是在发生反复感染后确诊，但由于80％的PID患儿没有家族史，且胎传抗体的存在使得PID患儿在6个月龄内的反复性感染并不明显，因此绝大多数PID患儿未能实现早诊断早干预。此外，新生儿出生24h内接种卡介苗，这可能导致PID患儿严重的副反应甚至致死。综上，建立有效的PID早期筛查和诊断方法，并进行新生儿筛查具有重要意义及社会价值。

造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation，HSCT)是治疗恶性血液疾病最有效的方法之一，而HSCT后患者的T细胞免疫重建的速度和质量与移植后感染和原发病的复发密切相关，是影响移植成功的关键所在。目前国内外多个实验室通过检测TREC来判断造血干细胞移植后T细胞免疫重建效果。HIV感染导致CD4+T淋巴细胞数量进行性减少是艾滋病最主要的免疫病理改变。研究表明艾滋病病人免疫功能能否重建，主要取决于胸腺的再生功能，且TREC可用于检测HIV患者免疫重建状况。多个临床研究表明HIV感染者随着CD4+细胞水平的下降，外周血中TREC细胞的水平也明显下降，而进行抗逆转录病毒治疗后TREC明显上升，TREC水平与HIV感染与治疗具有高度关联性。

T细胞是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤受感染细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，产生细胞因子等，是机体适应性免疫的重要组成部分。T细胞的发育开始于多能干细胞转变为淋巴样前体细胞，随后迁移至胸腺，经历一系列有序的分化过程，在胸腺发育成熟为识别各种抗原的T细胞库，迁往周围淋巴器官定居。因此胸腺输出T细胞能力可以在很大程度上反应T细胞发育情况。

胸腺T细胞的发育过程经历T细胞受体基因TCRA的重排，基因片段发生重排时会产生染色体外DNA环,该DNA环称为信号连接T细胞受体重排删除环(sjTREC)或TREC。TREC仅存在于近期从胸腺产生的T细胞中，不随着细胞增殖而扩增，因此可作为T细胞发育的标志物。TREC数量低下或缺如即表明幼稚T细胞不足，提示免疫缺陷，可用来早期筛查PID、评价HSCT效果及检测HIV患者免疫重建等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测TREC拷贝数的引物探针组、试剂盒及其应用，以克服上述技术不足。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：