[发明专利]检测ZFY基因的巢式PCR特异性引物、试剂盒及母猪早期妊娠诊断方法

说明书

本发明属于早期妊娠诊断技术领域，尤其涉及一种检测ZFY基因的巢式PCR特异性引物、试剂盒及母猪早期妊娠诊断方法。所述检测ZFY基因的巢式PCR特异性引物包括外侧引物和内侧引物，外侧引物和内侧引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1‑4所示。本发明通过两对灵敏度高、特异性强的引物，以母猪外周血中cffDNA为模板，第一轮外侧引物扩增增加了PCR的特异性，第二轮内部引物加强了PCR的灵敏度，通过两轮扩增，可以在妊娠第20天检测出母猪是否妊娠，检测结果准确性大大提高，为生猪养殖业尽早发现未妊娠母猪进行复配或淘汰决策、降低非生产天数和生产成本和提高母猪生产性能及经济效益提供了有力的技术支撑。

技术领域

本发明涉及早期妊娠诊断技术领域，特别涉及一种检测ZFY基因的巢式PCR特异性引物、试剂盒及母猪早期妊娠诊断方法。

背景技术

母猪配种分娩率是影响母猪生产效率的重要因素，母猪生产效率的衡量标准(PSY)＝年产窝数×窝均断奶仔猪数，保持较高的年产窝数和窝均断奶仔猪数是提高母猪生产效率的有效手段。而提高年产窝数要求必须尽早对配种后的母猪进行早期妊娠诊断，及时发现未妊娠的母猪并采取配种或淘汰的措施，以缩短母猪的非生产天数。母猪的发情周期一般为21天，如果在21天内无法确定母猪是否已经妊娠，则该母猪又要等一个发情周期，即21天后才能发情配种，错过一个发情周期将显著增加非生产天数，由此导致母猪饲养成本高、生产效率低。因此，准确地进行妊娠诊断对减少母猪非生产天数、降低生产成本十分重要。

传统母猪妊娠诊断常用的方法有外部观察法、超声波诊断法、阴道检查法、试情法等。但前述方法诊断时间天数较长、症状诊断不明确、受使用者的经验程度影响等，误诊、漏诊均有不同程度的存在。目前母猪妊娠诊断的最常用的为B超检测法，虽然准确性有所提高，但B超检测法需要在母猪妊娠30天左右开展才能达到较高的准确性，而配种失败的母猪会在21天后回到发情期，因此，B超检测法错过了失配母猪最佳配种时期，导致与非生产天数(NPDs)相关的成本增加。

随着无创性妊娠诊断技术的发展和应用，为了实现更早的妊娠诊断，部分学者开始关注于利用PCR方法对母猪外周血样本中SRY或AMELY等标志基因进行扩增，以此确定母猪是否妊娠，但是研究发现前述基因检测准确性不高，漏检、错减时有发生。因此，开发新的行之有效的早期(配种后21天以内)妊娠诊断技术对于缩短母猪非生产天数、增加年产胎次具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测ZFY基因的巢式PCR特异性引物，并提供了含有该巢式PCR特异性引物的试剂盒，以及利用该巢式PCR特异性引物检测母猪外周血中ZFY基因进行早期妊娠诊断的方法，能够在母猪配种后第20天(配种当天记为第0天)准确检测出其是否妊娠，检测准确性高。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的第一方面提供了一种检测ZFY基因的巢式PCR特异性引物，包括外侧引物和内侧引物，所述外侧引物包括上游引物ZFY-O-F和下游引物ZFY-O-R，所述内侧引物包括上游引物ZFY-I-F和下游引物ZFY-I-R，所述外侧引物和所述内侧引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-4所示。

本发明的第二方面提供了一种检测ZFY基因的试剂盒，包括如上所述的检测ZFY基因的巢式PCR特异性引物。

进一步地，所述外侧引物和所述内侧引物的摩尔比为10：1。

进一步地，所述检测ZFY基因的试剂盒还包括Es Taq Master Mix。

本发明的第三方面提供了一种检测ZFY基因的母猪早期妊娠诊断方法，包括以下步骤：

S1、采集母猪外周血样，提取所述母猪外周血样本中的DNA；

S2、以步骤S1提取的所述DNA为模板，利用如上所述的检测ZFY基因的巢式PCR特异性引物中的外侧引物进行第一轮扩增；