[发明专利]具有高效分泌表达非洲猪瘟病毒关键抗原P72的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了具有高效分泌表达非洲猪瘟病毒关键抗原P72的基因工程菌及其构建方法和应用，基因工程菌以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，将编码蛋白酶yow、AprE、NprE的信号肽核苷酸序列分别与优化改造的编码抗原P72的核苷酸序列进行融合构成新的融合基因SyP72、SAP72、SNP72转化到解解淀粉芽孢杆菌中得到三株基因工程菌株。本发明构建的最优工程菌株在优化的培养基中进行发酵培养，采用SDS‑PAGE电泳和Western Blot在发酵液中成功检测到重组抗原P72表达，蛋白含量达到4.5mg/mL；经口服和灌胃实验，表达的重组抗原P72能有效刺激小鼠P72抗体的产生。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及具有高效分泌表达非洲猪瘟病毒关键抗原P72的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

芽孢杆菌是革兰氏阳性菌。它只有一层膜结构，可以直接将细胞外酶分泌到培养基中，无需细胞破碎，无胞内蛋白污染，利于后续分离纯化。芽孢杆菌具有抗酸碱能力强、耐高温、耐高压、耐氧化、快速复活和较强分泌酶等特点，且分泌系统完善，能直接将许多蛋白分泌到培养基中,并且在重组蛋白的高效、经济的制备中具有独特的先天优势。目前，芽孢杆菌表达系统已经成功用于酶制剂、多肽类药物等外源蛋白的规模化制备。因此芽孢杆菌是一种理想的分泌表达宿主。

p72蛋白是由ASFV的B646L基因编码的病毒衣壳蛋白，基因全长为1941bp，蛋白大小为71.19kDa，蛋白序列高度保守，具有良好的免疫原性，使其成为检测感染猪的主要抗原之一。所以实现该抗原的高效表达对疫苗的研制具有积极作用。信号肽一般位于肽链的N-端，分为带正电的n区(1-3个残基)、以中性氨基酸为主且能形成α螺旋结构的疏水区(7-15个残基)以及带负电的信号肽酶切割信号肽的加工区(3-7个残基)三个区。芽孢杆菌作为常用的蛋白质分泌宿主菌，其包含的信号肽序列资源十分丰富，包括碱性蛋白酶类、淀粉酶类、蛋白酶类、金属蛋白酶类等多类型信号肽。现在抗原蛋白P72的获取通常使用大肠杆菌改造成基因工程菌株，这类基因工程菌株表达蛋白为胞内蛋白，在纯化时胞内蛋白需要经过细胞破碎等手段才能释放出来，同时伴随着大量的杂蛋白和等杂质，严重影响的后续分离纯化。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，在所得细胞破碎液中含有大量内毒素，去除不彻底会严重影响其医用效果。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种具有高效分泌表达非洲猪瘟病毒关键抗原P72的基因工程菌，能够在芽孢杆菌宿主中高效稳定分泌表达抗原P72，本发明用解淀粉芽孢杆菌作为宿主菌可以解决现有用大肠杆菌表达蛋白在蛋白破碎液中存在大量内毒素问题，在目的基因中添加信号肽用于引导外源蛋白分泌到胞外可以有效的减少杂蛋白，蛋白纯化步骤少降低抗原蛋白的损失率。

本发明还提供所述具有高效分泌表达非洲猪瘟病毒关键抗原P72的基因工程菌的构建方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述具有高效分泌表达非洲猪瘟病毒关键抗原P72的基因工程菌，所述基因工程菌以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，将编码蛋白酶yow、AprE、NprE的信号肽核苷酸序列分别与优化改造的编码抗原P72的核苷酸序列进行融合构成新的融合基因SyP72、SAP72、SNP72转化到解解淀粉芽孢杆菌中得到三株基因工程菌株，所述融合基因SyP72、SAP72、SNP72的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示。

其中，所述蛋白酶yow、AprE、NprE的信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO:4-6所示，优化改造的编码抗原P72的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

其中，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌CPLK1314。

本发明所述的具有高效分泌表达非洲猪瘟病毒关键抗原P72的基因工程芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)对P72蛋白核苷酸序列进行优化改造并分别与编码蛋白酶yow、AprE、NprE的信号肽核苷酸序列融合构成新的融合基因SyP72、SAP72、SNP72；