[发明专利]一种角质酶突变体及其在合成1，4-二乙酰哌嗪中的应用

说明书

一种角质酶突变体及其在合成1，4‑二乙酰哌嗪中的应用，属于酶工程技术领域。针对针对野生型角质酶对哌嗪类氮杂环底物识别性差、催化活性低的问题，本发明对天然的角质酶进行理性突变，获得了两种对哌嗪的识别与结合能力更强的角质酶突变体。将获得的角质酶突变体添加至含有哌嗪和乙酰基供体的溶剂中，可直接将哌嗪酰化为1，4‑二乙酰哌嗪，提高了1，4‑二乙酰哌嗪的产率。本发明为哌嗪类氮杂环化合物的酰化反应提供了新的生物催化工具。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种角质酶突变体及其在合成1，4-二乙酰哌嗪中的应用。

背景技术

哌嗪是一种重要的医药中间体，可合成磷酸哌嗪、胍哌、依诺沙星等几十种药物，还可用于生产湿润剂、乳化剂、分散剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、塑料加工和橡胶助剂等。哌嗪修饰的药物及功能试剂，主要通过酰化反应实现哌嗪分子的引入。哌嗪具有两个仲胺结构，通过乙酰化修饰、脱乙酰化反应，可实现两个仲胺分别连接不同的官能团，能够极大丰富药物结构种类，并显著影响该类化合物的药代动力学性质。因此，哌嗪的乙酰化反应，尤其是1，4-二乙酰哌嗪类化合物的构建对上述药物及功能试剂具有重要意义。目前1，4-二乙酰哌嗪的制备主要是利用传统化学法，该过程需要偶联试剂对羧酸活化，形成酰氯、酸酐、酰基叠氮化物等活性中间体，活性中间体进一步与胺进行亲核取代从而形成酰胺。但这种方法转化率很低，且要用到许多腐蚀性和毒性很大的试剂，导致原子经济性差。在绿色化学的要求下，迫切需要一种新的方法合成1，4-二乙酰哌嗪类化合物。

近年来，生物催化(酶催化)作为一种可持续的技术得到了普及，不需要任何保护或脱保护步骤，通常具有很高的对映选择性，可以在温和的条件下进行。本发明所使用的角质酶，属于α/β水解酶，具有角质酶特征性的甘氨酸(Gly)-酪氨酸(Tyr)-丝氨酸(Ser)谷氨酰胺(Gln)-甘氨酸(Gly)氨基酸序列以及丝氨酸(Ser)-组氨酸(His)-天冬氨酸(Asp)催化三联体，能够高效的催化脱水/水解反应。相对于脂肪酶，绝大多数角质酶没有脂肪酶结构中的“盖子”，因此角质酶的催化关键氨基酸丝氨酸暴露于溶剂；另外，角质酶催化三联体一般位于由疏水氨基酸包围的表面沟槽中，有利于容纳底物。这就为角质酶带来了较广的底物范围，如聚酯的聚合及降解，同时这一特性也为1，4-二乙酰哌嗪的生物催化制备提供了更多可能。

然而，由于酶催化具有温和性，该特点限制了酶在工业化中的应用。为获得更理想的催化活性或更广泛的反应条件，还需要在野生型的基础上，通过化学修饰改造、针对酶分子结构的非理性和理性设计等方法对现有的酶进行修饰改造。

发明内容

本发明针对针对野生型角质酶对哌嗪类氮杂环底物识别性差、催化活性低的问题，在原有角质酶序列(原有角质酶来源于米曲酶(Aspergillusoryzae)，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示)基础上进行突变，提供了一种具有更高催化效率的角质酶突变体。

本发明的具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种提高1，4-二乙酰哌嗪产率的角质酶突变体，所述角质酶突变体为下述突变体中的任意一种：

突变体cuitinaseM1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

突变体cuitinaseM2，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供上述角质酶突变体的编码序列：

所述突变体cuitinaseM1的编码序列如SEQ ID NO.3所示；

所述突变体cuitinaseM2的编码序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三个目的是提供含有上述编码序列的重组载体。

本发明的第四个目的是提供含有上述重组载体的重组菌。