[发明专利]一种角质酶突变体及其在合成1，4-二乙酰哌嗪中的应用

权利要求书

1.一种提高1，4-二乙酰哌嗪产率的角质酶突变体，其特征在于，所述角质酶突变体为下述突变体中的任意一种：

突变体cuitinaseM1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

突变体cuitinaseM2，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述角质酶突变体的编码序列，其特征在于，

所述突变体cuitinaseM1的编码序列如SEQ ID NO.3所示；

所述突变体cuitinaseM2的编码序列如SEQ ID NO.4所示。

3.含有权利要求2所述编码序列的重组载体。

4.含有权利要求3所述重组载体的重组菌。

5.权利要求1所述角质酶突变体、权利要求2所述编码序列、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组菌在合成1，4-二乙酰哌嗪中的应用。

6.一种合成1，4-二乙酰哌嗪的方法，其特征在于，所述方法是将哌嗪和乙酰基供体溶于溶剂中，加入权利要求1所述的角质酶突变体，催化获得1，4-二乙酰哌嗪。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述哌嗪浓度为0.1～5g/L；所述乙酰基供体为乙烯乙酸酯；所述乙烯乙酸酯与哌嗪的物质的量之比为2.2～3：1；所述角质酶的浓度为0.1～10mg/L。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、四氢呋喃、正己烷、乙酸乙酯和水中的任意一种或两种以上的混合物。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述催化的反应温度为20～50℃，反应时间为0.5～24h。

10.一种制备权利要求1所述角质酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建含编码所述角质酶突变体的基因的质粒载体；

(2)将突变体质粒导入大肠杆菌BL21中；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清即为角质酶突变体的粗酶液；

(4)利用镍柱对粗酶液进行蛋白纯化，得到目的蛋白，再使用超滤管进行浓缩，得到纯化酶。