[发明专利]一种快速定量检测发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种活菌数的方法

权利要求书

1.一种快速定量检测发酵乳中总双歧杆菌活菌数的引物，其特征在于，所述引物包括：

F：AACACATGCAAGTCGAACGG；

R：GGTCGGTCACGCATTACTCA。

2.一种快速定量检测发酵乳中乳双歧杆菌活菌数的引物，其特征在于，所述引物包括：

F：AAACGGTGGATGCTGGATGT；

R：TGAGTTTTTAGCCTTGCGGC。

3.一种快速定量检测发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种活菌数的方法，其特征在于，所述方法基于荧光定量PCR方法进行检测，具体包括如下步骤：

(1)对待测发酵乳进行前处理，收集乳清，备用；

(2)向所述乳清中加入叠氮溴化丙锭或叠氮溴化乙锭进行反应，收集反应沉淀物，备用；

(3)对所述反应沉淀物的总基因组进行提取；

(4)以提取的总核酸样本为模板，以权利要求1和/或2所述引物进行PCR扩增，并通过荧光定量PCR方法测定总双歧杆菌和/或乳双歧杆菌的活菌数。

4.根据权利要求3所述快速定量检测发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种活菌数的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述前处理步骤包括将待测发酵乳进行固液分离并收集乳清的步骤，以及，向所述乳清中加入亚铁氰化钾和硫酸锌进行反应并经固液分离收集乳清的步骤。

5.根据权利要求4所述快速定量检测发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种活菌数的方法，其特征在于，所述步骤(1)中：

所述亚铁氰化钾基于所述发酵乳的加入量为20-40mg/100g；

所述硫酸锌基于所述发酵乳的加入量为40-80mg/100g。

6.根据权利要求3-5任一项所述快速定量检测发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种活菌数的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述叠氮溴化丙锭或叠氮溴化乙锭的加入量基于所述乳清体积量为0.3-0.8×10^-3mmol/10ml乳清。

7.根据权利要求3-6任一项所述快速定量检测发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种活菌数的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述叠氮溴化丙锭或叠氮溴化乙锭反应的条件包括：室温避光孵育2-6分钟，于400-600W蓝光照射，控制光距15-25cm，控制光照时间5-20分钟。

8.根据权利要求3-7任一项所述快速定量检测发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种活菌数的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述PCR扩增步骤的条件包括：90-93℃、5-10min，60-62℃退火30-45s，70-75℃扩增30s，40-50循环，95℃热变性15s，溶解曲线温度95℃。

9.根据权利要求3-8任一项所述快速定量检测发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种活菌数的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，还包括按照拟合的标准曲线对发酵乳中总双歧杆菌和/或乳双歧杆菌的活菌数进行计算的步骤；其中，

所述总双歧杆菌活菌数的拟合标准曲线为：Y＝A1X+B1；

所述乳双歧杆菌活菌数的拟合标准曲线为：Y＝A2X+B2。

10.权利要求1中所述检测发酵乳中总双歧杆菌活菌数的引物或权利要求2中所述检测发酵乳中乳双歧杆菌活菌数的引物在快速定量检测发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种活菌数中的应用。