[发明专利]基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法

说明书

本发明提供一种基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法。本发明选取对虾传染性肌肉坏死病毒基因中MCP序列作为检测靶基因，针对靶基因设计合成ERA检测专用引物和探针，建立用于对虾传染性肌肉坏死病毒的ERA检测方法。本发明方法反应温度固定、操作程序简单、扩增速度快、检测效率高，且灵敏性和特异性良好，适用于IMNV的快速检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法。

背景技术

传染性肌肉坏死病毒(IMNV)是影响南美白对虾的传染性最强的病害之一，被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)列为甲壳动物主要疾病。传染性肌肉坏死病毒(IMNV)于2002年在巴西的一家凡纳滨对虾养殖场被首次发现。此后，于2006年在印度尼西亚报道，2017年印度也报告了该病毒。IMNV是全病毒科的成员，是由120个衣壳蛋白组成的正二十面体结构，无囊膜包被，直径约为40纳米。IMNV基因组是一个长度为7560bp的非分节的双链RNA，包含两个开放阅读框(ORF)，其中ORF1编码结构蛋白，即主要衣壳蛋白(MCP)和两种小蛋白(SP1和SP2)和假定的RNA结合蛋白。ORF2区域编码病毒特异性RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。根据RdRp基因同源性，该病毒被归类为节肢动物病毒Totivirus家族的贾第鞭毛虫病毒进化枝。患病对虾的主要症状是肌肉白浊、坏死，腹部末端及尾部明显，体表有不规则黑斑的症状。组织学检查显示骨骼肌严重凝固性坏死，可能伴有水肿、血细胞浸润和纤维化症状。在特定的环境因素下，IMNV相关死亡率可高达70％，该病毒对全球虾产业构成严重威胁，据估计已经造成数10亿美元的经济损失。

近年来，我国的对虾进口贸易日益增长，因此对虾疫病的实验室与实地检测量和需求增加。针对IMNV感染的诊断，基于临床体征和组织学检查，无法与其他病原体感染的体征区分开来，例如南美白对虾诺达病毒(PvNV)和细菌性病毒。基于核酸的方法包括原位杂交、反转录巢式PCR和反转录RT-PCR，是目前检测IMNV感染的高度特异和灵敏的方法，但需要精密的热循环仪器和较长的时间，不适合养殖者的虾场实地检测。等温扩增技术逐渐应用于病原检测中，如环介导等温扩增技术(LAMP)等，然而LAMP靶向序列为小片段内的6个或8个区域，引物设计受到许多限制，面临易被污染的高风险。酶促恒温扩增技术(ERA)是一种改良的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进行优化组合，从而获得核心的重组等温扩增体系。在37-42℃恒温条件下，可以使之将单分子DNA/RNA的特异性区段在5-10分钟内扩增10⁹倍。因此，进一步开发快速、灵敏高的反转录实时定量酶促恒温扩增技术(RT-ERA)的IMNV检测方法，有利于更好地实现对本病的预防和控制。

发明内容

本发明提出一种基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒检测方法及应用，利用实时定量酶促重组扩增技术(RT-ERA)建立了IMNV检测体系，不仅可快速实地实时检测，而且具有较高的特异性和灵敏性。

本发明采用了如下技术方案：

一种基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，包括以下步骤：

(1)选取对虾传染性肌肉坏死病毒基因中MCP序列作为检测靶基因，设计RT-ERA引物和探针；上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；

(2)以待测样品的基因组DNA为模板，采用步骤(1)设计的RT-ERA引物和探针，进行恒温RT-ERA扩增，得到RT-ERA扩增产物，检测其荧光信号强度，根据扩增曲线的荧光信号值，判断扩增结果。

优选的，所述探针为：