[发明专利]一种用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体提供了一种用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为5’‑CTTGAACAATGTACGCTACCGACAATTCG‑3’；所述下游引物的序列为5’‑CATCAATGCTTTATGGCCTCTGCGTGAAGTC‑3’。还包括探针5’‑FAM‑AGCTGTAGCCCTGCCTTGTAGCGAATGCGTTCTTG‑THF‑ATGC TGAAGCCTTG‑SpC3‑3’。本发明还提供了利用上述引物组合物检测长棘海星环境DNA的方法。突破了传统PCR检测手段的局限，实现了常温条件下长棘海星环境DNA的快速检测，在长棘海星种群动态监测和暴发成灾预警中拥有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物及其应用。

背景技术

珊瑚礁生态系统是海洋中生物多样性最丰富、初级生产力最高的生态系统之一。作为造礁石珊瑚最主要的敌害生物之一，长棘海星(Acanthaster planci)的灾害暴发是印度洋-西太平洋海域珊瑚覆盖率持续下降和珊瑚礁退化的主要原因之一。2019年至今，南沙群岛七岛礁海域均发生不同程度的长棘海星暴发灾害，部分海域珊瑚死亡率超过90％。东沙和中沙也分别在2019年和2020年监测到严重的长棘海星灾害。长此以往，将严重威胁到南海珊瑚礁生态系统健康，乃至整个南海海洋生物多样性和岛礁安全。

目前国际上有关长棘海星暴发的防控手段主要有药物注射、人工打捞移除、水下栅栏阻隔和生物防治等方法。然而，这些都是后置性应急处置措施。及早发现或预测到长棘海星的种群暴发，进行重点控制和集中管理，是开展长棘海星灾害处置的当务之急。随着分子生物学研究手段的不断发展，以环境DNA技术为代表的分子生态学检测手段为实现长棘海星种群动态的有效监测提供了可能。现阶段，对长棘海星环境DNA的检测方法主要是常规绝对定量PCR和荧光实时定量PCR。但是，常规绝对定量PCR需要特殊的热循环设备、其产物仍需电泳检测；荧光实时定量PCR具有较高的灵敏性，但反应过程时间长、需要具备荧光探测和分析的仪器。因此，现有的长棘海星环境DNA检测方法受制于上述缺陷，无法满足野外现场监测的需求。研发适用于长棘海星环境DNA检测的现场诊断技术对于有效防控长棘海星大规模种群暴发意义重大。

基于重组酶-聚合酶等温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)由英国公司TwistDx Inc开发。该技术依赖重组酶介导引物与目标片段序列结合，使核酸扩增反应脱离了传统PCR反应必须经历的变性、退火和延伸的热循环步骤，进一步触发聚合酶对目标片段进行指数扩增。最佳反应温度在反应速度快，10～20分钟即可获得可检出水平的扩增产物。针对RPA扩增产物的检测，实时荧光RPA可对扩增反应进程实时监控，但需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如可控温酶标仪或荧光PCR仪；相比而言，试纸条RPA对硬件条件要求更低，只需完成控温扩增反应，随后通过侧向流层析试纸条读取试验结果。因此，试纸条RPA更适合于现场检测的应用，本发明据此开发了基于试纸条RPA的长棘海星环境DNA检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有环境DNA检测技术需要特殊的设备，反应过程时间长，无法满足野外现场监测需求的问题。

为此，本发明提供了一种用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物，包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列为5’-CTTGAACAATGTACGCTACCGACAATTC G-3’

所述下游引物的序列为5’-CATCAATGCTTTATGGCCTCTGCGTGAA GTC-3’。

具体的，上述引物组合物还包括探针；所述探针的序列为5’-FAM-AGCTGTAGCCCTGCCTTGTAGCGAATGCGTTCTTG-THF-ATGC TGAAGCCTTG-SpC3-3’；其中，FAM表示羧基荧光素标记，THF表示四氢呋喃连接子形成缺刻，SpC3表示Spacer C3修饰。