[发明专利]一种用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物及其应用在审
| 申请号： | 202211703337.X | 申请日： | 2022-12-29 |
| 公开（公告）号： | CN116179719A | 公开（公告）日： | 2023-05-30 |
| 发明（设计）人： | 周智;朱云杰;刘兆群;吴钟解;唐佳;邢家杰 | 申请（专利权）人： | 海南大学;海南大学三亚研究院 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6844;G01N33/543;C12N15/11 |
| 代理公司： | 深圳市科进知识产权代理事务所(普通合伙) 44316 | 代理人： | 张桂平 |
| 地址： | 570228 *** | 国省代码： | 海南;46 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 检测 海星 环境 dna 引物 组合 及其 应用 | ||
1.一种用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物，其特征在于：包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的序列为5’-CTTGAACAATGTACGCTACCGACAATTC G-3’
所述下游引物的序列为5’-CATCAATGCTTTATGGCCTCTGCGTGAA GTC-3’。
2.如权利要求1所述的用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物，其特征在于：还包括探针；所述探针的序列为5’-FAM-AGCTGTAGCCCTG CCTTGTAGCGAATGCGTTCTTG-THF-ATGCTGAAGCCTTG-SpC3-3’；其中，FAM表示羧基荧光素标记，THF表示四氢呋喃连接子形成缺刻，SpC3表示Spacer C3修饰。
3.如权利要求1-2任意一项所述的用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物在长棘海星种群动态检测和灾害防控预警中的应用。
4.一种用于检测长棘海星环境DNA的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-2任意一项所述的引物组合物。
5.一种检测长棘海星环境DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在目标海域采集海水样品并提取总环境DNA；
(2)采用权利要求2提供的引物组合物进行RPA扩增反应；
(3)分析RPA扩增结果，判断海水样品中是否含有长棘海星。
6.如权利要求5所述的检测长棘海星环境DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计，包括：水化缓冲液29.5μL，280mM醋酸镁2.5μL，10μM上游引物和下游引物各2.1μL，探针引物0.6μL，长棘海星环境DNA模板5μL，DEPC水8.2μL。
7.如权利要求6所述的检测长棘海星环境DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为37℃恒温孵育20分钟。
8.如权利要求5所述的检测长棘海星环境DNA的方法，其特征在于，所述步骤(3)为：利用胶体金侧向流免疫层析试纸条分析RPA扩增产物，读取试纸条结果，判断是否含有长棘海星DNA扩增产物，进而判断海水样品中是否含有长棘海星。
9.如权利要求8所述的检测长棘海星环境DNA的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：将5μL RPA扩增产物加入95μL稀释液进行稀释，然后将稀释后RPA扩增产物滴加至胶体金侧向流免疫层析试纸条加样端，读取试纸条结果。
10.如权利要求9所述的检测长棘海星环境DNA的方法，其特征在于：所述稀释液包括25mM Tris、150mM NaCl和0.05％Tween20。
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