[发明专利]一种鉴别和定量检测多子小瓜虫的引物组及应用

说明书

本发明属于寄生性纤毛虫检测领域，具体涉及一种鉴别和定量检测多子小瓜虫的引物组及应用。本发明设计了一套用于特异性标记多子小瓜虫SSU rDNA的探针和引物，并将它们用于qPCR和ddPCR对多子小瓜虫进行鉴别和定量检测。经过优化反应条件后，qPCR方法和ddPCR方法对制备的标准质粒DNA都有很高的线性相关性。在检测多子小瓜虫水环境DNA样本时，qPCR方法有着更宽的检测范围，使它能够用于监测小瓜虫病的流行情况。与此同时，ddPCR方法有着更加灵敏的检测性能，使得它可以在成分复杂的水环境中检测出极为少量的多子小瓜虫DNA。

技术领域

本发明属于寄生性纤毛虫检测领域，具体涉及一种鉴别和定量检测多子小瓜虫的引物组及应用。

背景技术

多子小瓜虫是一种严重危害淡水鱼类的寄生性纤毛虫，它没有宿主特异性，能够寄生在热带、亚热带和温带的多种重要经济鱼类上。多子小瓜虫的生活史可以分为三个阶段：(1)滋养体阶段：寄生在宿主身上，以宿主的细胞和体液为食；(2)包囊阶段：掉落在水中，进行二分裂；(3)掠食体阶段：在水中自由游动，寻找新宿主。滋养体寄生在宿主的体表或鳃上时，能够使细胞和组织发生明显形变，导致宿主的调节渗透压功能和氧气交换功能受损。而且，当滋养体成熟后，离开宿主时，使宿主的表皮屏障损坏，增加了其它病原如嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila等继发性感染的概率。因此，一旦多子小瓜虫病在高密度养殖池塘暴发，将会导致大量鱼类死亡和高额经济损失。

由于滋养体被宿主的上皮组织包裹，包囊有一层包囊壁保护，所以难以在不伤害宿主的前提下杀灭这两个阶段。只有从包囊中孵化出的掠食体后，在还未侵入宿主体内之前，才容易用药物杀灭。与此同时，掠食体的体积约为38.5–73.5μm×14.5–40.5μm，难以用肉眼直接观察到。当在宿主身上观察到肉眼可见的白点时，小瓜虫病实则已入膏肓。所以有必要发明一种早期检测技术来定量水体中多子小瓜虫的数量，用于预警小瓜虫病的暴发和提示用药预防。

虽然一直认为小瓜虫属只有多子小瓜虫一个种，但是基于虫体表面抑动抗原的组成成分，有多种血清型被鉴定出来。近年来，基于细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome coxidase subunit I(cox-1))和线粒体NADH脱氢酶亚基I(mitochondrial NADHdehydrogenase subunit I(nad1_b))基因序列，多个地区的不同基因型也被鉴定出来。基于此事实，我们需要设计一种特异性探针和配套引物，用来区分多子小瓜虫和其他淡水纤毛虫，以及在世界各地的不同多子小瓜虫株系间通用。

目前多子小瓜虫的鉴定方法有三种。第一种是形态学检测方法，使用培养孵化法、固定标本的染色法和甘油酒精透明法对多子小瓜虫进行鉴定。此方法要求的设备和试剂繁多、步骤冗长，鉴定所需时间较长；第二种是普通PCR检测方法，利用特异性引物扩增多子小瓜虫DNA来鉴定，鉴定无法做到定量；第三种是荧光定量PCR检测方法，利用特异性引物和荧光染料定量鉴定多子小瓜虫，但需要建立标准曲线，步骤繁琐，且染料法特异性不高，无法区别非特异性产物及引物二聚体。

在此发明中，我们设计了一个特异性Taqman-MGB探针及其配套引物，用于鉴别多子小瓜虫核糖体小亚基DNA(SSU rDNA)。并将它们配合实时荧光定量PCR技术(qPCR)和数字微滴PCR技术(ddPCR)用于定量，比较了两种技术在检测多子小瓜虫时的线性范围、动态范围、最低检测限(limit of detection(LOD))、最底定量限(limit of quantification(LOQ))，组内差异性(intra-assay variation)和组间差异性(inter-assay variation)。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鉴别和定量检测多子小瓜虫的引物组及应用。

本发明第一方面涉及一种鉴别多子小瓜虫的引物组，该引物组包括引物Ich_18S_568F、Ich_18S_656R、Ich_18S_597P，序列如下：