[发明专利]一种长片段捕获富集方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开一种长片段捕获富集方法、试剂盒及其应用。该方法包括：将长片段待检测样本与杂交缓冲液孵育，然后与捕获探针在适于杂交的条件下进行杂交；利用分离磁珠捕获探针‑目标片段复合物，再使用清洗缓冲液清洗；经PCR富集和纯化后，得到捕获产物。本发明建立了一种高效捕获达到5Kb以上长片段的富集方法，本发明对5Kb片段的富集效率是传统方法的2倍以上。同时，本发明的实验体系更简单，操作更方便，实验流程更加简便。此外，本发明通过降低探针密度，使得25％探针密度仍然保持与100％探针密度相近的富集效率，能够有效节省探针，显著降低成本。

技术领域

本发明涉及一种长片段捕获富集方法，更具体地，本发明涉及一种长片段捕获富集方法、试剂盒及其应用。

背景技术

第二代测序(NGS)的出现，改变了基因组学和相关临床领域研究，但在某些应用中，NGS技术仍然受到测序读长较短的限制，例如长重复序列或假基因变异检测等。而在临床检测应用中，长Indels、结构变异以及单倍型检测是NGS技术的瓶颈。

NGS的读长只能达到600bp(300PE)，而第三代测序(TGS)则可以达到1Kb以上的测序长度，某些第三代测序仪甚至可以获得大于10kb的读长[Van D,Yan J,Delphine N,etal.The Third Revolution in Sequencing Technology[J].Trends in Genetics,2018:S0168952518300969-.]，因此，TGS技术的长读长优势可以帮助克服上述限制，包括长Indel和结构变异检测等[Min,Wang,Christine,et al.PacBio-LITS:a large-insert targetedsequencing method for characterization of human disease-associatedchromosomal structural variations[J].Bmc Genomics,2015.]。

虽然TGS的测序成本在不断降低，但全基因组检测仍然非常昂贵。基于杂交捕获的靶向富集(靶向捕获)技术通过探针与感兴趣的目标区域片段结合，靶向富集目标区域片段，可以有效节约测序数据，降低成本，并提高检测准确性。

在NGS领域，靶向捕获技术已经广泛应用。但在TGS技术中，靶向捕获技术研究较少。其中有几个方面的问题需要进一步解决，首先，传统杂交缓冲液是否适合长片段DNA的杂交捕获，其次，传统杂交流程较为繁琐，能否进一步减少试剂种类和操作步骤；最后，针对长片段DNA杂交捕获，如何进行探针设计，实现用更少的探针保证高效的目标区域富集。

背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于建立一种更简便的长片段杂交捕获方法，一方面，在探针设计上，在保证富集效率的同时减少探针数量，使得检测方法更经济。另一方面，通过优化杂交清洗缓冲液组分，提高长片段富集效率，并简化杂交捕获流程，实现高效、简便的长片段DNA靶向富集。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种长片段捕获富集方法，其包括如下步骤：

(1)将长片段待检测样本与杂交缓冲液孵育，然后与捕获探针在适于杂交的条件下进行杂交；

(2)利用分离磁珠捕获探针-目标片段复合物，再使用清洗缓冲液清洗；

(3)经PCR富集和纯化后，得到捕获产物。

在某些实施方案中，根据本发明所述的长片段捕获富集方法，其中，所述长片段的长度为1-10Kb，优选为1-8Kb，还优选为1-5Kb，例如1、2、3、4、5Kb或期间任意数值范围的片段长度。