[发明专利]一种长片段捕获富集方法、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种长片段捕获富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将长片段待检测样本与杂交缓冲液孵育，然后与捕获探针在适于杂交的条件下进行杂交；

(2)利用分离磁珠捕获探针-目标片段复合物，再使用清洗缓冲液清洗；

(3)经PCR富集和纯化后，得到捕获产物。

2.根据权利要求1所述的长片段捕获富集方法，其特征在于，所述长片段的长度为1-10Kb。

3.根据权利要求1所述的长片段捕获富集方法，其特征在于，所述探针的密度为5％-100％。

4.根据权利要求1所述的长片段捕获富集方法，其特征在于，所述杂交缓冲液包含0.3-0.8M的3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液，和用于降低高GC目标区域退火温度的试剂以及用于提高低GC目标区域的退火温度的试剂和10-40％(v/v)的甲酰胺。

5.根据权利要求4所述的长片段捕获富集方法，其特征在于，

所述用于降低高GC目标区域退火温度的试剂包括：0.5-1.5M海藻糖、甜菜碱和/或二甲基亚砜；

所述用于提高低GC目标区域的退火温度的试剂包括0.5-1.5M四甲基氯化铵、四乙基氯化铵和/或四丙基氯化铵。

6.根据权利要求1所述的长片段捕获富集方法，其特征在于，所述清洗缓冲液包括热清洗缓冲液和室温清洗缓冲液，其中，所述热清洗缓冲液组分包含0.05-1.15M的3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液，和0.05-0.15％Tween-20、0.05-0.15％SDS，pH5.8-7.0；所述室温清洗缓冲液组分包含0.05-0.15M 3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液，pH 5.0-6.5。

7.根据权利要求1所述的长片段捕获富集方法，其特征在于，步骤(1)中所述待检测样本包含DNA和/或RNA。

8.根据权利要求1所述的长片段捕获富集方法，其特征在于，步骤(1)中，适于杂交的条件是指55-70℃，5-24h。

9.一种用于长片段捕获富集的试剂盒，其特征在于，包括：

I.杂交缓冲液；和

II.清洗缓冲液；

其中，所述杂交缓冲液包含0.3-0.8M的3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液，和用于降低高GC目标区域退火温度的试剂以及用于提高低GC目标区域的退火温度的试剂和10-40％(v/v)的甲酰胺；

所述清洗缓冲液包括热清洗缓冲液和室温清洗缓冲液；

优选地，所述用于降低高GC目标区域退火温度的试剂包括：0.5-1.5M海藻糖、甜菜碱和/或二甲基亚砜；

优选地，所述用于提高低GC目标区域的退火温度的试剂包括0.5-1.5M四甲基氯化铵、四乙基氯化铵和/或四丙基氯化铵；

优选地，所述清洗缓冲液包括热清洗缓冲液和室温清洗缓冲液，其中，所述热清洗缓冲液组分包含0.05-1.15M的3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液，和0.05-0.15％Tween-20、0.05-0.15％SDS，pH 5.8-7.0；所述室温清洗缓冲液组分包含0.05-0.15M 3-吗啉丙磺酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液，pH 5.0-6.5。

10.根据权利要求9所述的试剂盒在长片段靶向测序中的用途。