[发明专利]多重RNA向导的基因组工程

说明书

本发明提供了多重RNA向导的基因组工程。具体提供了将外源核酸序列多重插入表达Cas9酶的细胞中的DNA内的方法，所述酶同与靶DNA互补的向导RNA形成共定位复合物并以位点特异性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：(a)将多种向导RNA和多种外源供体核酸序列引入至所述细胞中，其中所述多种向导RNA与所述靶DNA的不同位点互补，其中所述多种RNA中的各向导RNA和所述Cas9酶是与所述靶DNA的共定位复合物的成员，以及(b)重复步骤(a)以在所述细胞中对于所述DNA产生多种外源核酸的插入。

技术领域

本申请属于基因工程领域，具体涉及多重RNA向导的基因组工程。

背景技术

细菌和古细菌CRISPR-Cas体系(system)凭借短的向导RNA形成Cas蛋白复合物以指导存在于侵入的外来核酸内的互补序列的降解。参见Deltcheva，E.et al.CRISPR RNAmaturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.Nature 471，602-607(2011)；Gasiunas,G，Barrangou,R.，Horvath,P.Siksnys,V.Cas9-crRNAribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptiveimmunity in bacteria.proceedings of the National Academy of Sciences 109,E2579-2586(2012)；Jinek,M.et al.Aprogrammable dual-RNA-guided DNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.Science 337,816-821(2012)；Sapranauskas,R.etal.The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity inEscherichia coli.Nucleic acids research 39,9275-9282(2011)；以及Bhaya,D.,Davison,M.Barrangou,R.CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea:versatilesmall RNAs for adaptive defense and regulation.Annual review of genetics 45,273-297(2011)。最近化脓性链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR体系的体外重构(reconstitution)证实了融合至正常反式编码的tracrRNA(“反式激活的CRISPR RNA”)的crRNA(“CRISPR RNA”)足以指导Cas9蛋白序列特异地切割匹配该crRNA的靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9募集(recruitment)和靶DNA的降解。参见H.Deveau etal.,Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcusthermophilus.Journal of Bacteriology 190,1390(Feb,2008)。

发明内容

本公开内容的方面旨在使用一种或多种x向导RNA(核糖核酸)多重修饰在细胞中的DNA以指导由细胞表达的具有核酸酶活性的酶，如具有核酸酶活性的DNA结合蛋白，至该DNA(脱氧核糖核酸)上的靶位置(target location)，其中，该酶剪切DNA并且使外源供体核酸插入至该DNA中，如通过同源重组。本公开内容的方面包括在细胞上循环或者重复DNA修饰步骤以生成在细胞内具有多重DNA修饰(modification)的细胞。修饰可以包括外源供体核酸的插入。