[发明专利]多重RNA向导的基因组工程在审
| 申请号： | 202211491551.3 | 申请日： | 2014-07-08 |
| 公开（公告）号： | CN116042726A | 公开（公告）日： | 2023-05-02 |
| 发明（设计）人： | 乔治·M·丘奇;詹姆士·迪卡洛 | 申请（专利权）人： | 哈佛大学校长及研究员协会 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/81 |
| 代理公司： | 上海专利商标事务所有限公司 31100 | 代理人： | 杨昀;余颖 |
| 地址： | 美国马*** | 国省代码： | 暂无信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 多重 rna 向导 基因组 工程 | ||
1.一种将外源核酸序列多重插入表达Cas9酶的细胞中的DNA内的方法，所述酶同与靶DNA互补的向导RNA形成共定位复合物并以位点特异性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：
(a)将多种向导RNA和多种外源供体核酸序列引入至所述细胞中，其中所述多种向导RNA与所述靶DNA的不同位点互补，其中所述多种RNA中的各向导RNA和所述Cas9酶是与所述靶DNA的共定位复合物的成员，
其中，所述Cas9酶切割所述DNA以产生切割位点，并且将所述多种外源供体核酸序列中的一种插入至所述DNA中，以及
(b)重复步骤(a)以在所述细胞中对于所述DNA产生多种外源核酸的插入。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是酵母细胞、植物细胞或者动物细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述向导RNA是约10个至约500个之间的核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述向导RNA是约20个至约100个之间的核苷酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述向导RNA是tracrRNA-crRNA融合体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA是基因组DNA、线粒体DNA、病毒DNA、或外源DNA。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，通过重组插入所述供体核酸序列。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，通过同源重组插入所述供体核酸序列。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述向导RNA存在于质粒上。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述供体核酸包括侧接所述剪切位点的臂或同源序列。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述供体核酸包括用于除去所述切割位点的序列。
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