[发明专利]一种高效异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种高效异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明采用枯草芽孢杆菌多位点基因组整合的方式，构建amyE、lacA、lipA、eglS四位点整合型重组菌株，可有效提高麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase在枯草芽孢杆菌中的高效表达，同时实现麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase在枯草芽孢杆菌中的同源异体表达，并进行双酶转化法生产海藻糖。

技术领域

本发明涉及一种高效异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是由两分子葡萄糖通过1,1-糖苷键连接而成的非还原性二糖。由于海藻糖具有甜度适中，性质稳定，不易分解，无还原性和对生物大分子具有保护作用，其广泛应用于食品、化妆品、医药等行业。

海藻糖生产主要途径包括磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法。其中双酶法是以麦芽糊精或淀粉糖化液为底物，麦芽糊精经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)催化生产麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖经过麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)催化生成海藻糖。双酶法具有生产成本低、转化率高、产物便于分离提取等特点，受到广泛关注。目前国内生产海藻糖内毒素含量较高，限制了海藻糖在食品和医药领域的应用。枯草芽孢杆菌是食品安全菌株，不产生内毒素。但目前枯草芽孢杆菌对麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶异源的表达量比较低，限制了枯草芽孢杆菌在海藻糖生产中的应用。

为提高MTSase和MTHase在枯草芽孢杆菌中的表达，本发明通过多位点整合的方式，提高基因拷贝数，进一步提高MTSase和MTHase的表达；同时将MTSase和MTHase在枯草芽孢杆菌中进行异源同体表达，降低MTSase和MTHase的生产成本。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用。

本发明的技术方案如下：

一种高效异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤1、构建枯草芽孢杆菌amyE位点整合质粒pDG-amyE-P₄₃-MTSase-amyE，包括如下步骤：

(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P₄₃基因片段；

(2)以嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段；

(3)以pDG1730质粒为模板，反向PCR扩增获得pDGamyE线性化载体基因片段；

(4)利用无缝克隆技术，分别将步骤(1)中的启动子P₄₃基因片段、步骤(2)中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段、步骤(3)中的pDGamyE线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌amyE位点整合质粒pDG-amyE-P₄₃-MTSase-amyE。

步骤2、构建枯草芽孢杆菌lacA位点整合质粒pDG-lacA-P₄₃-MTSase-Cm-lacA，包括如下步骤：

①以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lacA上游同源臂基因片段；

②以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lacA下游同源臂基因片段；

③以pDG-amyE-P₄₃-MTSase-amyE质粒为模板，PCR扩增P₄₃-MTSase基因片段；