[发明专利]一种高效异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用

权利要求书

1.一种高效异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、构建枯草芽孢杆菌amyE位点整合质粒pDG-amyE-P₄₃-MTSase-amyE，包括如下步骤：

(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P₄₃基因片段；

(2)以嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段；

(3)以pDG1730质粒为模板，反向PCR扩增获得pDGamyE线性化载体基因片段；

(4)利用无缝克隆技术，分别将步骤(1)中的启动子P₄₃基因片段、步骤(2)中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段、步骤(3)中的pDGamyE线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌amyE位点整合质粒pDG-amyE-P₄₃-MTSase-amyE；

步骤2、构建枯草芽孢杆菌lacA位点整合质粒pDG-lacA-P₄₃-MTSase-Cm-lacA，包括如下步骤：

①以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lacA上游同源臂基因片段；

②以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lacA下游同源臂基因片段；

③以pDG-amyE-P₄₃-MTSase-amyE质粒为模板，PCR扩增P₄₃-MTSase基因片段；

④以pHT01质粒为模板，PCR扩增获得氯霉素Cm抗性基因片段；

⑤以pDG1730质粒为模板，反向PCR扩增获得pDGlacA线性化载体基因片段；

⑥利用无缝克隆技术，分别将步骤①中的lacA上游同源臂基因片段、步骤③中的P₄₃-MTSase基因片段、步骤④中的氯霉素Cm抗性基因片段、步骤②中的lacA下游同源臂基因片段、步骤⑤中的pDGlacA线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌lacA位点整合质粒pDG-lacA-P₄₃-MTSase-Cm-lacA；

步骤3、构建枯草芽孢杆菌lipA位点整合质粒pDG-lipA-P₄₃-MTSase-Em-lipA，包括如下步骤：

[1]以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lipA上游同源臂基因片段；

[2]以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lipA下游同源臂基因片段；

[3]以pDG-lacA-P₄₃-MTSase-Cm-lacA质粒为模板，PCR扩增P₄₃-MTSase基因片段；

[4]以pMAD质粒为模板，PCR扩增获得红霉素Em抗性基因片段；

[5]以pDG1730质粒为模板，反向PCR扩增获得pDGlipA线性化载体基因片段；

[6]利用无缝克隆技术，分别将步骤[1]中的lipA上游同源臂基因片段、步骤[3]中P₄₃-MTSase基因片段、步骤[4]中的红霉素Em抗性基因片段、步骤[2]中的lipA下游同源臂基因片段、步骤[5]中的pDGlipA线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌lipA位点整合质粒pDG-lipA-P₄₃-MTSase-Em-lipA；

步骤4、构建枯草芽孢杆菌eglS位点整合质粒pDG-eglS-P₄₃-MTHase-Km-eglS，包括如下步骤：

A以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增eglS上游同源臂基因片段；

B以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增eglS下游同源臂基因片段；

C以pHT01-P₄₃-MTHase质粒为模板，PCR扩增P₄₃-MTHase基因片段；

D以pMA5质粒为模板，PCR扩增获得卡那霉素Km抗性基因片段；

E以pDG1730质粒为模板，反向PCR扩增获得pDGeglS线性化载体基因片段；

F利用无缝克隆技术，分别将步骤A中的eglS上游同源臂基因片段、步骤C中的P₄₃-MTHase基因片段、步骤D中的卡那霉素Km抗性基因片段、步骤B中的eglS下游同源臂基因片段、步骤E中的pDGeglS线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌eglS位点整合质粒pDG-eglS-P₄₃-MTHase-Km-eglS；

步骤5、构建枯草芽孢杆菌amyE单位点整合菌株Bacillus subtilis/amyE::P₄₃-MTSase：

将步骤1构建的pDG-amyE-P₄₃-MTSase-amyE质粒转化进B.subtilis WB800N中，制得amyE单位点整合菌株B.subtilis WB800n/amyE::P₄₃-MTSase；

步骤6、构建枯草芽孢杆菌amyE和lacA双位点整合菌株Bacillus subtilis/amyE::P₄₃-MTSase/lacA::P₄₃-MTSase：

将步骤2构建的pDG-lacA-P₄₃-MTSase-Cm-lacA质粒转化进B.subtilis WB800n/amyE::P₄₃-MTSase中，制得amyE、lacA双位点整合菌株B.subtilis WB800n/amyE::P₄₃-MTSase/lacA::P₄₃-MTSase；

步骤7、构建枯草芽孢杆菌amyE、lacA和lipA三位点整合菌株Bacillus subtilis/amyE::P₄₃-MTSase/lacA::P₄₃-MTSase/lipA::P₄₃-MTSase：

将步骤3构建pDG-lipA-P₄₃-MTSase-Em-lipA质粒转化进B.subtilis WB800n/amyE::P₄₃-MTSase/lacA::P₄₃-MTSase中，制得amyE、lacA、lipA三位点整合菌株B.subtilisWB800n/amyE::P₄₃-MTSase/lacA::P₄₃-MTSase/lipA::P₄₃-MTSase；

步骤8、构建枯草芽孢杆菌amyE、lacA、lipA和eglS四位点整合菌株Bacillussubtilis/amyE::P₄₃-MTSase/lacA::P₄₃-MTSase/lipA::P₄₃-MTSase/eglS::P₄₃-MTHase：

将步骤4构建的pDG-eglS-P₄₃-MTHase-Km-eglS质粒转化进B.subtilis WB800n/amyE::P₄₃-MTSase/lacA::P₄₃-MTSase/lipA::P₄₃-MTSase中，制得amyE、lacA、lipA、eglS四位点整合菌株B.subtilis WB800n/amyE::P₄₃-MTSase/lacA::P₄₃-MTSase/lipA::P₄₃-MTSase/eglS::P₄₃-MTHase，即异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌。