[发明专利]萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法及应用

说明书

本发明公开了一种萝卜基因组特有single‑locus IP标记的开发方法及应用，该方法利用生物信息学技术，在萝卜和芸薹属作物基因组信息基础上，开发萝卜特有single‑locus IP标记；并将这些标记实际应用于萝卜‑芸薹种间杂交后代萝卜外源导入片段的鉴定中。本发明实现以萝卜为供体与芸薹属作物远缘杂交后代优良基因片段的快速鉴定，有效辅助优良基因片段的精准导入，同时对涉及的基因片段大小进行准确追踪，打破不良连锁累赘，实现种质资源的高效创制和利用。同时为杂种后代改良性状相关基因的染色体片段鉴定提供重要的数据支持。

技术领域

本发明涉及萝卜分子标记生物技术领域，具体涉及一种萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法及应用。

背景技术

萝卜属与芸薹(Brassica)属是十字花科中两个非常重要的近缘属。早在1924年Karpechenko就开始进行萝卜属和芸薹属作物之间的杂交试验，以创造新的物种或实现基因渐渗。迄今，萝卜中已有多个有益基因通过萝卜与芸薹属作物之间的远缘杂交而导入到芸薹属作物中，如Ougra-CMS细胞质雄性不育基因与恢复基因、抗TuMV基因、抗甜菜根结线虫基因等。同时许多优异的萝卜-芸薹属作物种间杂种后代也被应用于芸薹属作物实际育种工作中。如何准确鉴定与强化筛选萝卜-芸薹种间杂交后代中的外源萝卜染色体片段至关重要，这是打破被改良作物不良基因连锁累赘的必要技术基础。

目前，仅利用芸薹属受体作物基因组信息所开发的分子标记，已无法满足萝卜-芸薹种间杂交后代中萝卜外源片段的准确鉴定。

发明内容

本发明针对萝卜-芸薹种间杂交后代中外源萝卜片段的鉴定困难的缺陷，提供一种萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法及应用，该方法利用生物信息学技术，在萝卜和芸薹属作物基因组信息基础上，开发萝卜特有single-locus IP标记；并将这些标记实际应用于萝卜-芸薹种间杂交后代萝卜外源导入片段的鉴定中。

为实现上述目的，本发明所涉及一种萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法，包括以下步骤：

1)萝卜基因组信息获取：获取多个萝卜品种的基因组信息；

2)引物设计：在Linux系统下，基于任意一种萝卜基因组注释信息与其对应的参考基因组序列信息，使用Perl语言编写脚本批量提取其所有基因内含子两侧外显子序列，生成Primer3.0所需格式文件；使用primer3_2.5.0软件批量设计引物；

3)电子PCR分析：执行e-pcr程序(ePCR_2.3.9)将引物和其余的萝卜基因组数据库进行电子PCR分析，生成引物电子PCR分析结果；通过韦恩图(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)作图分析得到多个萝卜基因组共有单位点(single-locus)扩增的多条IP标记引物；

4)萝卜特有single-locus IP标记分析：利用上述多条IP标记引物，分别在甘蓝型油菜泛基因组，白菜，甘蓝，芥菜型油菜基因组进行e-PCR分析，通过软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/calculate_venn.htpl)绘制韦恩图；对电子PCR结果进行反向选择，即舍弃预期在甘蓝型油菜，白菜，甘蓝与芥菜型油菜任一参考基因组中预期有扩增的萝卜single-locus IP标记引物，最终仅保留在多个萝卜基因组中预期均扩增单一位点，同时不在甘蓝型油菜，白菜，甘蓝与芥菜型油菜任一参考基因组中预期有PCR产物的标记位点，最终得到多条萝卜基因组特有single-locus IP标记引物；