[发明专利]萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法及应用

权利要求书

1.一种萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)萝卜基因组信息获取：获取多个萝卜品种的基因组信息；

2)引物设计：在Linux系统下，基于任意一种萝卜基因组注释信息与其对应的参考基因组序列信息，使用Perl语言编写脚本批量提取其所有基因内含子两侧外显子序列，生成Primer3.0所需格式文件；使用primer3_2.5.0软件批量设计引物；

3)电子PCR分析：执行e-pcr程序将引物和其余的萝卜基因组数据库进行电子PCR分析，生成引物电子PCR分析结果；通过韦恩图作图分析得到多个萝卜基因组共有单位点扩增的多条IP标记引物；

4)萝卜特有single-locus IP标记分析：利用上述多条IP标记引物，分别在甘蓝型油菜泛基因组，白菜，甘蓝，芥菜型油菜基因组进行e-PCR分析，通过软件绘制韦恩图；对电子PCR结果进行反向选择，即舍弃预期在甘蓝型油菜，白菜，甘蓝与芥菜型油菜任一参考基因组中预期有扩增的萝卜single-locus IP标记引物，最终仅保留在多个萝卜基因组中预期均扩增单一位点，同时不在甘蓝型油菜，白菜，甘蓝与芥菜型油菜任一参考基因组中预期有PCR产物的标记位点，最终得到多条萝卜基因组特有single-locus IP标记引物；

5)萝卜基因组特异single-locus IP特异性验证：根据多条特有single-locus IP标记引物扩增位点在萝卜基因组的分布情况，以物理间隔约为2Mb的原则，每条染色体上挑选25-30对引物；进行实际PCR扩增和琼脂糖凝胶检测，判断上述标记在实际应用中的效果；检测所用材料为来自国内外的萝卜材料、甘蓝型油菜品种、白菜品种、甘蓝、芥菜；依据验证结果，共有多对single-locusIP标记引物对为萝卜材料中特异扩增，而在油菜、白菜、甘蓝和芥菜中无扩增；以上多对single-locusIP标记引物对即为可实际应用的一套萝卜特有single-locus IP标记引物对组。

2.根据权利要求1所述萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法，其特征在于：所述步骤1)中，萝卜基因组信息来自4个萝卜品种，分别为Qing、Rsa10、Xin-li-mei和RS01。

3.根据权利要求1所述萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法，其特征在于：所述步骤2)中，萝卜品种为Rsa10；设计引物参数设置为：

PRIMER_OPT_SIZE＝22，

PRIMER_MIN_SIZE＝18，

PRIMER_MAX_SIZE＝24，

PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE＝80-450。

4.根据权利要求1所述萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法，其特征在于：所述步骤3)中，电子PCR分析参数设置为：-n 2-g 1-m 60，即允许左右引物各有2个错配，1个gap；

剩余萝卜品种为Qing、Xin-li-mei和RS01；IP标记引物的条数为58412条。

5.根据权利要求1所述萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法，其特征在于：所述步骤4)中，萝卜基因组特有single-locus IP标记引物条数为25448条。

6.根据权利要求1所述萝卜基因组特有single-locus IP标记的开发方法，其特征在于：所述步骤5)中，single-locus IP标记引物对有192对。

7.一种权利要求1所述方法开发的萝卜特有single-locus IP标记在萝卜-芸薹杂交后代中外源萝卜片段鉴定中的应用。

8.一种鉴定萝卜-芸薹杂交后代中外源萝卜片段的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述方法得到萝卜特有single-locus IP标记引物对组。