[发明专利]一种RNA-DNA嵌合接头及其应用

说明书

本发明提出一种RNA‑DNA嵌合接头及其应用，属于生物分析检测以及基因测序领域，尤其涉及一种用于确保单个解旋酶结合以及阻滞解旋酶移动的测序接头序列设计、构建方法以及应用。采用RNA结合DNA的方式，特异性保证解旋酶在接头上的结合位置、个数等；而RNA‑DNA杂合结构具有比单独RNA双链结构更稳定的特性，并且只能被RNaseH所识别(RNaseH特异性识别RNA‑DNA杂合结构)，切除RNA‑DNA杂合结构中的RNA链，从而暴露出作为引导链的单链DNA。adapter引入Cy3，Cy3能够有效阻滞Dda。本发明所述的RNA‑DNA嵌合adapter主要应用在纳米孔测序中，通过本发明实验的系统验证，该adapter以及adapter mix能够有效进行纳米孔测序。

技术领域

本发明属于生物分析检测以及基因测序领域，尤其涉及一种RNA-DNA嵌合接头及其应用。

背景技术

纳米孔测序技术是近年被开发出来的新型核酸测序技术。依据孔道类型可分为固态孔和生物纳米孔，生物纳米孔即能够允许底物通过的孔道蛋白，以下纳米孔测序单指生物纳米孔测序技术。在电场力的作用下，带电核酸底物能够通过生物纳米孔。当核酸通过纳米孔时，能够阻碍纳米孔的电流，产生不同的电流信号，通过对电流信号的解析，可以获得核酸的碱基信息。

测序常用底物多为双链DNA或RNA，而双链核酸无法自由穿过纳米孔，需要能将核酸双链解旋形成单链，或者采用聚合的方式，以双链核酸为模板合成单链，因此，在纳米孔测序过程中，多采用解旋酶或者聚合酶等生物酶来得到由双链产生单链的目的。此外，电场力作用下(180mV)，单链核酸底物穿过纳米孔速度过快，以至于检测电流无法记录。所以还需要对待测单链核酸进行限速，此时解旋酶或者聚合酶本身的活性(解旋效率，聚合效率)都能起到限速的作用。

测序过程中，接头(adapter)是由长度不同的互补DNA退火形成的单双链结构(overhang，图1)，它的主要作用是，1.单链区作为引导序列，将adapter与解旋酶复合物(adapter mix)引向孔道附近，产生底物过孔电场力；2.后续双链区连接待测双链DNA底物；3.单双链交会区，结合解旋酶，并将解旋酶阻滞于此，在产生过孔电场力前不能解开双链结构(在由ATP和Mg²⁺条件下)。单链区可以结合多个解旋酶(多数解旋酶在无ATP和Mg²⁺会停在单双链嵌合位置)，这样会造成引导序列短，还可以引起多个解旋酶作用存在差异，使得解旋效率变低。已有专利(WO2014135838A1)，常用策略是采用iSp18、iSpC3等不含碱基基团的核苷酸类似物来阻滞或者封堵解旋酶的结果，在保证引导序列足够长的前提下，常用多个iSp18等核苷酸类似物(非天然氨基酸)串联。这种方案首先合成这些类似物存在较大难度，步骤繁琐，串联效率低且串联个数较多时，链容易断裂。不均一的adapter会影响解旋酶的结合数量，阻滞效果，从而影响测序效率；其次，合成成本较高。因此，保证单个解旋酶结合在adapter上，以及阻滞解旋酶的方案存在需要。

发明内容

采用RNA结合DNA的方式，特异性保证解旋酶在接头上的结合位置、个数等；而RNA-DNA杂合结构具有比单独RNA双链结构更稳定的特性，并且只能被RNaseH所识别(RNaseH特异性识别RNA-DNA杂合结构)，切除RNA-DNA杂合结构中的RNA链，从而暴露出作为引导链的单链DNA。在RNA结合时，adapter单链区只允许一个解旋酶分子结合，以此排除多个解旋酶结合，对于解旋活性以及多个解旋酶对adapter引导序列结合使得待测样品进孔效率变差。同时，为了阻止解旋酶在接头上的非目的性移动(接头制备过程，测序过程，ATP等需要先与待测DNA孵育，此时解旋酶会具有活性而解开双链DNA区域)，本发明还提供一种解旋酶的阻滞方案，即在单双链交会处引入Cy3(四甲基吲哚-碳菁)，Cy3在ATP和Mg²⁺存在的条件下，无外加电场时，Cy3能够有效阻滞Dda的解旋能力。经过鉴定，本发明所述方案能够产生有效的纳米孔测序数据。