[发明专利]一种槲皮素-3,4`-O-二葡萄糖苷的合成方法及其所用到的酶

说明书

本发明公开了一种槲皮素‑3,4'‑O‑二葡萄糖苷的合成方法及其所用到的酶，以拟南芥（Arabidopsis thaliana）来源的UGT78D2和洋葱（Allium cepa）来源的UGT73G1突变体73G1_V371A为研究对象，利用蛋白质工程手段改造UGT78D2区域选择性以及73G1_V371A可溶性表达。同时引入蔗糖合酶（Sucrose synthase，SuSy），分别与73G1_V371A和UGT78D2及其突变体构成偶联体系，实现UDPG循环再生，并对SuSy的磷酸化突变进行了比较研究。最终搭建三酶共表达催化体系S31D‑F378S‑V371A，以槲皮素和蔗糖为底物催化合成Q3,4'G，转化合成Q3,4'G的量为4.4±0.03 g/L，产槲皮素‑3,4＇‑O‑二葡萄糖苷的产量较原始酶有显著的提高。

技术领域

本发明涉及一种糖基转移酶突变体并采用生物酶催化法以槲皮素为底物生成较高浓度的Q3,4′G糖苷产物的应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

槲皮素是人类植物性食物和药物成分中最常见、分布最广泛的黄酮之一，为黄酮醇类化合物，常以槲皮素糖苷的形式广泛存在于多种植物的花、果实和叶中，是许多其他类黄酮苷的苷元。槲皮素已被证明具有抗炎、抗癌、预防糖尿病、保护神经和心脏、预防骨质疏松和抗过敏等多种生物活性。研究表明，槲皮素在啮齿动物模型的体外和体内的抗氧化潜力，是通过增加线粒体活性和抑制萎缩因子来实现的。槲皮素的抗氧化活性主要来自其结构中的儿茶酚基团和大量游离的羟基。槲皮素还被广泛用作膳食补充剂，日常膳食中，人们每天摄入的黄酮类物质中，接近2/3都是槲皮素及其相关衍生物。此外，槲皮素还被添加到功能性食品中。

研究表明，与槲皮素相比，槲皮素双糖苷在多个方面具有更强的生物活性。如槲皮素双糖苷在抑制恶性肿瘤增殖活性、抑制HIV-1和HSV-1/2的活性等方面均优于槲皮素，在抑制乙酰胆碱酯酶活性方面优于槲皮素。因而，槲皮素双糖苷在抗癌、抗阿尔兹海默症、抗HIV等方面具有巨大的应用潜力。其次，槲皮素双糖苷具有更好的生物利用度，其有着适宜的分子极性，相比槲皮素具有更好的水溶性以及更高的肠上皮吸收率。

槲皮素-3,4′-O-二葡萄糖苷(Q3,4′G)是被研究最多的类黄酮二葡萄糖苷之一，它比槲皮素或槲皮素单糖苷更易溶于水。大量研究表明，Q3,4′G具有抗氧化和神经保护作用，其在维持神经元存活和清除自由基方面可能具有重要意义。另外，它还具有抗菌抗炎、降血压、抗病毒等药理学功能。然而，其在自然界中含量较低，若采用传统的提取方法，不仅产量低、成本高，且污染大，不利于可持续发展。自然界中存在大量的槲皮素，但因其水溶性差，导致生物利用度低，使得它不能得以充分利用。若是能利用槲皮素为原料，转化合成Q3,4′G，不仅能够充分利用现有的槲皮素资源，还能生成具有更高生物利用价值的槲皮素衍生物。

当前已有槲皮素3-O-糖苷酰基化衍生物合成的相关报道，具体包括体外酶法合成和全细胞生物转化法。体外酶合成法是以生物酶作为生物催化剂，在体外以可控的方式进行酶法合成是生物合成槲皮素3-O-糖苷酯的主要方式。目前，已开发出4种能执行槲皮素3-O-糖苷体外酰基化修饰的工具酶，分别为酰基转移酶、脂肪酶、蛋白酶以及酯酶。其中的水解酶因其易获得性、经济性、宽泛的区域选择性、良好的溶剂耐受性以及不需要辅助因子等特性，可作为更优的催化剂用于槲皮素3-O-糖苷的体外酰化修饰。尽管脂肪酶等水解酶在槲皮素3-O-糖苷酯的体外酶促合成的研究已较为广泛，但脂肪酶介导的酰化反应往往需要在有机溶剂中进行，易造成环境污染，且不利于和其他水溶性途径酶进行偶联。全细胞生物催化剂可在一定程度上解决上述问题，因此也是获取槲皮素3-O-糖苷酯的一种重要手段。但是在操作过程中，溶剂的选择是非水相生物转化法的关键因素，它不仅影响底物的溶解度，还影响整个细胞的催化活性。槲皮素3-O-糖苷具有较高的极性，因此需要极性较强的有机溶剂增大其溶解度。然而，强极性有机溶剂会与蛋白活性中心的结合水相互作用，使蛋白失去活性。此外，有机溶剂的使用也会改变细胞膜的完整性和细胞形态。