[发明专利]一株无特定抗性基因枯草芽孢杆菌及应用

权利要求书

1.一株无特定抗性基因枯草芽孢杆菌，其特征在于，该无特定抗性基因枯草芽孢杆菌命名为BSC6ΔA8菌株，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M20221478。

2.如权利要求1所述的无特定抗性基因枯草芽孢杆菌株，其特征在于，所述无特定抗性基因枯草芽孢杆菌为中国典型培养物保藏中心命名的菌株Bacillus subtilis C6的衍生菌株，所述菌株Bacillus subtilis C6在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M20221478。

3.权利要求1或2所述的无特定抗性基因枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统敲除所述菌株Bacillus subtilis C6的10个抗性基因获得，敲除总片段合计约7.9 kb；所述10个抗性基因包括：四环素耐药基因ykkC和ykkD，链霉素耐药基因vgbA和aadK，螺旋霉素耐药基因mph，喹诺酮类耐药基因bmr和blt，衣霉素耐药基因tmrB以及林克霉素耐药基因lmrA和lmrB。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以pJOE8999载体作为出发载体构建CRISPR/Cas9基因敲除载体；

2）使用CRISPROR工具进行sgRNA引物设计，并在5’端添加BsaI酶切的互补配对碱基即得到最终的sgRNA引物序列，引物退火连接至BsaI酶切的pJOE8999线性载体，各靶基因的同源臂修复序列通过无缝克隆连接至SalI和XbaI酶切位点之间；

3）根据拟敲除的基因上下游序列信息，设计基因敲除的同源臂扩增引物分别扩增上下游同源臂修复片段并纯化回收；

4）CRISPR/Cas9完成基因敲除以后，通过温度变化进行质粒去除，获得无抗性标记的基因敲除菌；

5）通过依次敲除10个抗性基因，最终获得的抗性基因敲除菌命名为BSC6ΔA8；

6）评估野生型枯草芽孢杆菌和基因敲除菌BSC6ΔA8对不同抗菌药物的敏感性。