[发明专利]一种高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表达应用

说明书

本申请公开了一种高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表达应用，以催化活性位点处水的O原子与肽键的酰胺C原子间距离为基础进行理性设计提高胃蛋白酶活性，对胃蛋白酶进行人工分子改造，筛选得到酶活显著提高的突变体。本发明通过对胃蛋白酶的序列、结构和功能进行深入研究，从稳定催化结构和促进催化反应两方面对胃蛋白酶进行突变，获取在工业生产中更具备应用价值的高活力酶。

技术领域

本申请涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表达应用。

背景技术

能够切割蛋白质中肽键的酶被称为蛋白酶，它们在自然界中广泛存在。胃蛋白酶是一种十分重要的蛋白酶，它是研究天冬氨酸蛋白酶最经典常用的模型蛋白，而且在饲料添加剂、奶制品凝乳、果汁澄清、酿酒原料加工、皮革处理等工业生产中有广泛应用。目前，胃蛋白酶在毕赤酵母体系中已经成功实现了异源表达。毕赤酵母是一种甲醇营养型的酵母，已成为实验室和工业生产重组蛋白的重要工具，具备翻译后可修饰、易操作等优势。Yoshimasu等人利用AOX启动子驱动的pHIL-S1和PHO1信号肽在毕赤酵母中实现了猪胃蛋白酶的分泌表达，从1L发酵液中获得了～30.0mg的重组胃蛋白酶(Yoshimasu M A,Ahn J-K,Tanaka T,et al.Soluble expression and purification of porcine pepsinogen fromPichia pastoris[J].Protein Expression Purif,2002,25(2):229-236.)。安立国等人构建了胃蛋白酶原毕赤酵母pPIC3.5K-P.pastoris GS115的胞内可溶表达系统，通过纤维蛋白消化和干酪素平板筛选出高表达菌株，并优化了发酵条件，最终获得了～56.0mg/L的表达量(刘西梅,安立国,乔宪凤,et al.猪胃蛋白酶原a在毕赤酵母中的表达[J].江汉大学学报(自然科学版),2008,(03):59-63.)。

酶的活力是评价酶的生产应用价值的重要依据之一，它是指酶催化某一化学反应的能力，可以通过一定条件下单位时间内单位体积的底物减少量或产物生成量来表示。在工业应用中，高活力的酶具有更短的反应时间，更少的酶用量，更高的底物转化率和更低的生产成本。因此，工业生产中对高催化活性酶的需求迫切。在试管中模拟自然选择的定向进化策略是提高酶活性的常用方法，主要可分为两个关键步骤：第一步是在目标基因中引入突变，创建丰富多样的突变基因；第二步是对基因多样性文库的翻译产物——蛋白质文库进行筛选，识别具有活性改进的蛋白质。构建突变基因文库的技术主要有易错PCR、随机引物体外重组、过度模板随机嵌合生长、DNA改组等(陈虹.L-天冬氨酸-α-脱羧酶的蛋白质工程改造及其在β-丙氨酸生产中的应用[D]；浙江工业大学,2019.)；常用的筛选方法有微孔板筛选、细胞筛选、液滴筛选等多种高通量筛选法。尽管定向进化策略大幅推动了蛋白质工程的发展，但是实验过程中需要构建庞大的突变文库，工作量大且效率较低。

酶是专一性、高效性的天然生物催化剂，在食品、医药、废物处理等行业广泛使用，推动了高效、经济、环保的工业发展。然而，科学技术的发展推动了工业生产的变革更新，大部分天然蛋白质的功能特性已经不能满足工业加工的特定需求，需要研究者对酶进行优化改造，从而获得适用于工业条件的酶制剂。胃蛋白酶是研究天冬氨酸蛋白酶最经典常用的模型蛋白，且在饲料添加剂、奶制品凝乳、果汁澄清、酿酒原料加工、皮革处理等工业生产中有广泛应用。然而胃蛋白酶的活性距离理论极限仍然有很大的距离，其活性有很大的提升空间。关于胃蛋白酶、甚至天冬氨酸蛋白酶活性设计的研究很少，无法满足工业发展的需求。

因此，如何通过构建小而精的突变文库即可实现高酶活胃蛋白酶的有效筛选一直是本领域技术人员致力于研发的方向之一。

发明内容

本申请的主要目的在于提供一种高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表达应用，选择关键残基进行饱和或半饱和突变，构建小而精的突变文库实现有效筛选，以解决目前的问题。

为了实现上述目的，本申请提供了如下技术：