[发明专利]一种高酶活胃蛋白酶的人工改造酶及其分子改造方法和表达应用有效
| 申请号： | 202211425013.4 | 申请日： | 2022-11-15 |
| 公开（公告）号： | CN115806960B | 公开（公告）日： | 2023-10-20 |
| 发明（设计）人： | 缪廷炜;冯英慧;荣明利;张鲁嘉;吴迎红;沈涛;杜新园 | 申请（专利权）人： | 华东师范大学;宁夏夏盛实业集团有限公司;沧州夏盛酶生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/64 | 分类号： | C12N9/64;C12N15/57;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12N15/31;C12R1/19;C12R1/84 |
| 代理公司： | 上海湾谷知识产权代理事务所(普通合伙) 31289 | 代理人： | 倪继祖 |
| 地址： | 200062 上*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 高酶活 胃蛋白酶 人工 改造 及其 分子 方法 表达 应用 | ||
1.一种高酶活胃蛋白酶的人工改造酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
2.编码权利要求1所述高酶活胃蛋白酶的人工改造酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。
4.一种重组表达载体，其包含权利要求3中所述的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求4中所述的重组表达载体。
6.权利要求2所述基因在分泌表达胃蛋白酶中的应用。
7.根据权利要求6中所述的基因在分泌表达胃蛋白酶中的应用，其特征在于：
将所述的通过半理性设计、定点突变得到的新的人工改造的胃蛋白酶基因在原核细胞中，与用于原核细胞进行基因操作所用的穿梭表达质粒连接构成重组表达质粒；将重组表达质粒转化入真核细胞表达蛋白并整合入真核细胞基因组中得到重组酵母；培养重组酵母，诱导胃蛋白酶的分泌表达。
8.根据权利要求7中所述的应用，原核细胞为大肠杆菌。
9.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于：真核细胞表达蛋白是毕赤酵母Pichiapastoris GS115表达蛋白。
10.一种如权利要求1所述的高酶活胃蛋白酶的人工改造酶的分子改造方法，其特征在于，包括以下步骤：
以PDB编号4PEP为结构模板，以催化活性位点处水的O原子与肽键的酰胺C原子间距离为基础进行理性设计提高胃蛋白酶活性，对胃蛋白酶进行人工分子改造，筛选得到酶活显著提高的突变体。
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