[发明专利]一种高抗凝血海参肠多糖及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种高抗凝血海参肠多糖，其特征在于，所述高抗凝血海参肠多糖分子量为25.1-171.5kDa，单糖组成包括岩藻糖；

所述海参肠多糖从海参肠中提取获得；

所述高抗凝血海参肠多糖分子量为171.5kDa，单糖组成包括岩藻糖，总糖含量为53.36％，蛋白含量为0.67％，硫酸基含量为28.31％；

所述岩藻糖由非硫酸化岩藻糖，4-硫酸化岩藻糖及2-硫酸化岩藻糖或2,4-硫酸化岩藻糖构成；

所述高抗凝血海参肠多糖的制备方法，包括如下步骤：

S1、将海参肠干燥粉碎、脱脂；

S2、向脱脂后的海参肠粉中加入乙酸钠缓冲液、木瓜蛋白酶、EDTA及半胱氨酸进行酶解提取，提取后固液分离，收集上清液；

S3、向上清液中加入氯化十六烷基吡啶CPC溶液，室温反应10-30h，收集沉淀；

S4、将沉淀溶解于NaCl溶液-乙醇混合溶液中，搅拌均匀后与乙醇混合静置，收集沉淀部分；

S5、将步骤S4所得沉淀用乙醇洗涤、烘干后，透析脱盐，浓缩、冻干得到混合海参肠多糖；

S6、将混合海参肠多糖通过Q-Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离，洗脱、收集洗脱液得到海参肠多糖；

所述透析脱盐，截留分子量为6000Da；

所述洗脱具体为：依次用蒸馏水、1mol/L氯化钠水溶液、2mol/L氯化钠水溶液、3mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集1、2、3mol/L氯化钠洗脱组分。

2.权利要求1所述高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将海参肠干燥粉碎、脱脂；

S2、向脱脂后的海参肠粉中加入乙酸钠缓冲液、木瓜蛋白酶、EDTA及半胱氨酸进行酶解提取，提取后固液分离，收集上清液；

S3、向上清液中加入氯化十六烷基吡啶CPC溶液，室温反应10-30h，收集沉淀；

S4、将沉淀溶解于NaCl溶液-乙醇混合溶液中，搅拌均匀后与乙醇混合静置，收集沉淀部分；

S5、将步骤S4所得沉淀用乙醇洗涤、烘干后，透析脱盐，浓缩、冻干得到混合海参肠多糖；

S6、将混合海参肠多糖通过Q-Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离，洗脱、收集洗脱液得到海参肠多糖；

所述透析脱盐，截留分子量为6000Da；

所述洗脱具体为：依次用蒸馏水、1mol/L氯化钠水溶液、2mol/L氯化钠水溶液、3mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集1、2、3mol/L氯化钠洗脱组分。

3.根据权利要求2所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，海参肠干燥方式为冷冻干燥；

所述脱脂具体为：取粉碎得到的海参肠粉，加入5-10倍体积的丙酮浸泡脱脂。

4.根据权利要求2所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，所述乙酸钠缓冲液浓度为0.1-0.3mol/L；粉碎得到的海参肠粉与乙酸钠缓冲液的料液比为1：20-30g/mL；

所述木瓜蛋白酶酶活为700-900U/mg；每克粉碎得到的海参肠粉采用0.04-0.08g木瓜蛋白酶处理；

所述EDTA及半胱氨酸终浓度均为4-6mmol/L；

或，所述酶解提取，提取温度为50-70℃，时间为20-30h。

5.根据权利要求4所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，所述乙酸钠缓冲液浓度为0.1mol/L；所述木瓜蛋白酶酶活为800U/mg；所述EDTA及半胱氨酸终浓度均为5mmol/L。

6.根据权利要求2所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，所述CPC溶液质量体积比为10％；粉碎得到的海参肠粉与CPC溶液的料液比为1：1.6-2g/mL；

或，所述NaCl溶液-乙醇混合溶液中NaCl溶液与乙醇的体积比为100:15。

7.根据权利要求6所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，所述NaCl溶液浓度为2-3mol/L，乙醇的浓度为95％，体积百分数。