[发明专利]一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法

说明书

本发明公开一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法，属于生物技术领域。CRISPR/Cas13a可以靶向RNA，通过合理设计crRNA，使Cas13a/crRNA特异性识别RNA，激活Cas13a的反式切割活性，导致引物发卡被Cas13a切割从而释放出引发链。随后，该引发链触发无酶催化发卡自组装放大反应，实现病毒RNA的超灵敏检测。本发明与常规核酸检测技术相比具有如下优点：(1)检测耗时短，整个反应在30分钟内即可完成；(2)直接进行一步法检测，无需分步进行，避免了反复开盖导致的气溶胶污染和假阳性结果；以上优点为核酸检测提供了新的思路。

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法。

背景技术

病毒是一种严格的细胞寄生生物，只能依靠宿主进行增殖，具有非生命与生命两种不同的状态，能够感染所有的生命形式，如动物、植物、细菌、真菌及古生菌等。因此，发展高效、快速的检测方法是预防病毒性人类疾病和植物病害的主要手段。由于宿主不同，病毒的检测方法亦有所不同，但大致可分为以下两类，一类为免疫检测方法，一类为分子生物学方法。免疫学检测主要通过抗原与抗体的特异性反应，进而实现对病毒的鉴定。分子生物学方法是基于病毒核酸的分析方法，主要有聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)等一系列分子生物学分析方法。其中，PCR方法具有灵敏度高、可定量分析等优点，广泛应用于病毒的检测。

肠道病毒(enterovirus,EV)归属于微小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。目前已经报道的EV有116种血清型，分属于15个组：EV-A至EV-L，以及鼻病毒A-C组。埃可病毒11型属于EV-B组肠道病毒，是最常见的肠道病毒之一，绝大多数重症或致死性肠道病毒感染均是由埃可病毒11型所致，特别是新生儿，因免疫系统尚未完善，可通过胎盘、产道感染或因家属、医护人员手部卫生不达标等原因导致交叉感染，容易引起病房内的暴发流行，造成严重后果。1977年至今，国外已报道多起新生儿病房内埃可病毒11型的暴发，死亡率高；国内目前多为散发病例，存在新生儿院内感染的隐患。目前临床常用的埃可病毒11型检测方法是利用聚合酶链式反应(PCR)扩增VP1区序列后进行测序鉴定，但该方法检测周期较长(约2～3天)、操作过程复杂、扩增过程还需要酶参与。

因此，开发一种快速、特异、灵敏的病毒RNA诊断技术刻不容缓。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法，包括如下步骤：

(1)根据待检RNA的序列设计crRNA；设计发卡探针H1、发卡探针H2和引物发卡-12；

所述的发卡探针H1的寡核苷酸序列为：5’-ATTGGCACCCGCAATAGGATTAATAGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’，其中5’端修饰有荧光染料，3’端修饰有猝灭基团；

所述的发卡探针H2的寡核苷酸序列为：5’-AGGATTAATAGCAGGATTGGCACCCGCAATCCTGCTATTAATCCTATTGCGGG-3’；

所述的引物发卡-12的寡核苷酸序列为5’-TAGCAGGATTGCGGrUrUrUrUrUATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’。

(2)配制包含Cas13a、crRNA、引物发卡-12、待检样品、发卡探针H1、发卡探针H2和缓冲溶液的反应体系进行扩增反应。所述的缓冲溶液优选为50mM Tris-HCl。所述的反应的条件优选为25～45℃反应10～60分钟。