[发明专利]一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步快速检测方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)根据待检RNA的序列设计crRNA；

设计发卡探针H1、发卡探针H2和引物发卡-12；

所述的发卡探针H1的寡核苷酸序列为：5’-ATTGGCACCCGCAATAGGATTAATAGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’，其中5’端修饰有荧光染料，3’端修饰有猝灭基团；

所述的发卡探针H2的寡核苷酸序列为：5’-AGGATTAATAGCAGGATTGGCACCCGCAATCCTGCTATTAATCCTATTGCGGG-3’；

所述的引物发卡-12的寡核苷酸序列为：5’-TAGCAGGATTGCGGrUrUrUrUrUATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’；

(2)配制包含Cas13a、crRNA、引物发卡-12、待检样品、发卡探针H1、发卡探针H2和缓冲溶液的反应体系进行扩增反应；

(3)在步骤(2)的反应液中加入水转入荧光比色皿中，或直接将反应液转入荧光比色皿中，设置激发波长为485nm，测量其在发射波长505～550nm范围的荧光光谱图；

(4)定性检测：如果荧光强度有增加则待检样品中含待检RNA；

定量检测：将荧光强度的增加值代入到定量检测待检RNA的工作曲线中，得到待检RNA的含量；所述的定量检测待检RNA的工作曲线为根据荧光强度的增加值与待检RNA浓度的对数的关系作出的线性曲线；

所述荧光强度的增加值为存在待检RNA时的荧光强度值减去无待检RNA时的荧光强度值。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的缓冲溶液为50mM Tris-HCl。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：步骤(2)中的反应体系如下：1μL 500nM Cas13a、2.5μL 200nM crRNA、1μL2.5μM引物发卡-12，5μL待检RNA、2μL 5μM发卡探针H1、4μL 10μM发卡探针H2和34.5μL缓冲溶液。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：步骤(2)中反应的条件为25～45℃反应10～60分钟。

5.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas13a和无酶恒温扩增的病毒RNA一步检测方法，其特征在于：所述的病毒为埃可病毒11型时，crRNA的寡核苷酸序列为：5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACUGCAUUUAUAUAUUGACACAACC-3’或5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCAUAGUGAUCAACAGCUUCCAGC-3’。

6.一种检测病毒RNA的试剂盒，其特征在于：包含Cas13a、crRNA、引物发卡-12、发卡探针H1、发卡探针H2；

所述的发卡探针H1的寡核苷酸序列为：5’-ATTGGCACCCGCAATAGGATTAATAGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’，其中5’端修饰有荧光染料，3’端修饰有猝灭基团；

所述的发卡探针H2的寡核苷酸序列为：5’-AGGATTAATAGCAGGATTGGCACCCGCAATCCTGCTATTAATCCTATTGCGGG-3’；

所述的引物发卡-12的寡核苷酸序列为5’-TAGCAGGATTGCGGrUrUrUrUrUATTGGCACCCGCAATCCTGCTA-3’。