[发明专利]谷氨酸脱羧酶突变体H465W及其在γ-氨基丁酸生产中的应用

说明书

本发明属于基因工程和酶工程领域，公开了谷氨酸脱羧酶突变体H465W及其在γ‑氨基丁酸生产中的应用，所述突变体是来源于大肠杆菌（Escherichia coli str.K‑12 substr.MG1655NC_000913.3）的野生型谷氨酸脱羧酶第465位氨基酸由组氨酸H突变为色氨酸W得到。通过谷氨酸脱羧酶的活性测定分析，发现相较于野生型谷氨酸脱羧酶，本发明的谷氨酸脱羧酶突变体H465W在不同pH条件下都表现出明显提高的酶活性，显示其更适合工业化生产γ‑氨基丁酸。

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程领域，具体涉及谷氨酸脱羧酶突变体H465W及其在γ-氨基丁酸生产中的应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种4-碳非蛋白质氨基酸，其在食品、农业、医药和其他领域均具有广泛的应用。(Xu et al.,2017；Sarasa et al.,Curr.Microbiol,2020,77(4):534-544)。大量研究表明，GABA是一种广泛存在于哺乳动物中枢神经系统中的抑制性神经递质，具有许多重要的生理功能，如利尿、调节血压、镇静作用等(Baritugo,K.A.,MicrobCell Fact,2018,17(1):129)。此外，在生化工业中，GABA也被用于合成工业产品，如2-吡咯烷酮和可生物降解的聚酰胺尼龙4。

目前，γ-氨基丁酸生产包括化学合成法、植物富集法和微生物合成法等。但是受到苛刻的反应条件及昂贵的天然原料的限制，利用化学合成法生产GABA安全性较差、有化学残留；植物富集法虽然安全性好，但制得的GABA浓度太低，无法作为医药、食品添加剂。谷氨酸脱羧酶(GAD)(EC 4.1.1.15)能不可逆地催化L-谷氨酸(盐)转化生成γ-氨基丁酸，是生物转化法合成γ-氨基丁酸的关键酶制剂，具有巨大的市场应用价值。

近些年来，大量不同来源的谷氨酸脱羧酶被克隆并表征，如：大肠杆菌来源的GadB，巨大芽孢杆菌来源的GadB，乳酸杆菌的GadA和GadB等。然而，GAD的嗜酸性和低酶活限制了其在工业上的应用。因此，探索和鉴定性能优良、活性高的新型GADs是非常有必要的。Jun等通过优化GadB(Escherichia coli)的N端结构域，提高了其热稳定性。Fang等通过对短乳杆菌CGMCC No.1306和Thermococcus kodakarensis的GAD同源序列比对，在GAD的13个残基位置引入脯氨酸，获得了耐热性较高的突变酶G364P。但是，目前国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低，尤其是在偏中性条件下，这一特性已经严重影响了其在工业上的应用前景。

因此，通过筛选或定向突变改造谷氨酸脱羧酶，获得在不同pH条件下具有较高催化活力的GAD，并基于此构建高效生物催化系统，为工业化应用于高产γ-氨基丁酸提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种谷氨酸脱羧酶突变体H465W，所述突变体为SEQ IDNO.3所示。

本发明的另一个目的在于提供了谷氨酸脱羧酶突变体H465W在催化生产γ-氨基丁酸中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人将来源于大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655NC_000913.3)的野生型谷氨酸脱羧酶第465位氨基酸由组氨酸H突变为色氨酸W，得到了本发明的谷氨酸脱羧酶突变体H465W，为SEQ ID NO.3所示。

本发明的保护内容还包括：编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因。

以上所述的基因优选的，为SEQ ID NO.4所示。

表达SEQ ID NO.3所示蛋白的重组菌株。

以上所述的重组菌株，是将谷氨酸脱羧酶突变体H465W的表达载体转化进地衣芽胞杆菌所得。