[发明专利]一种葡萄糖脱氢酶酶活测定方法

说明书

本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶酶活测定方法，包括以下步骤：S1.在PMS反应溶液中加入待测的葡萄糖脱氢酶液，反应完成后立即加入酸调节溶液pH≤3.0终止葡萄糖脱氢酶反应，离心、去除上清液保留沉淀；S2.取DCIP检测溶液，测量DCIP检测溶液在600nm处的初始吸光值，在S1的沉淀中加入DCIP检测溶液，得到混合溶液，反应结束后再次测量混合溶液在600nm下的反应后吸光值，将反应后吸光值与初始吸光值的差值代入DCIP标准曲线计算得参与反应的DCIP摩尔质量，计算得葡萄糖脱氢酶的酶活数值。本发明使测量数据保持真实性，不会因操作过快过慢或者设备反应时间等其他因素导致实验结果的偏差过大。控制反应进行方向，最大限度的控制副反应，避免其影响实验结果。

技术领域

本发明涉及酶制剂检测和应用领域，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶酶活测定方法。

背景技术

葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase)，高等动物(牛、羊、狗、猫等)的肝脏及弱氧化醋杆菌(Acetobacter subaxydans等)中存在的一种酶催化D-葡萄糖+NAD(P)D-葡糖酸(的内酯)+NAD(P)H的反应。来源于动物的酶(EC.1.1.1.47)既能利用NAD，也能利用NADP。虽然对D-木糖也显有25％的活性，但对其他天然己糖和戊糖则几乎没有作用(动物)。醋酸杆菌属(Acetobacter)的酶(EC1.1.1.119)对NADP具有是特异的作用，但也能作用于D-甘露糖。

目前葡萄糖脱氢酶酶活检测方法多为DCIP显色法，DCIP显色法酶活检测定义为：溶液中每分钟还原1μmol DCIP所需的酶量定义为一个酶活单位。DCIP显色法检测酶活步骤：取100μL适当稀释的酶液，加入3ml显色液(50mmol/L pH7.0的PB缓冲液，0.03mmol/L的DCIP，1.6mmol/L的PMS，100mmol/L的葡萄糖溶液)轻轻混匀，用重蒸水调零，37℃每隔1min记录600nm处吸光值的变化，共记录2-3min。用酶的缓冲液代替酶液作为对照。不同文献中所使用的方法一致，仅显色液配方成份浓度有所差别。

检测机理：

DCIP显色法检测原理如下：

2MPH+DCIP→2PMS+re-DCIP

其中D-Glucose为葡萄糖；PMS为5-甲基吩嗪硫酸甲酯；D-glucono-δ-lactone为葡萄糖酸-δ-内酯；MPH为1-甲基吩嗪；DCIP为2,6-二氯酚靛酚；re-DCIP为还原态DCIP；GDH为葡萄糖脱氢酶。

PMS转化为MPH反应机理如下式1；DCIP转化为无色re-DCIP反应机理如式二；

利用试剂盒检测价格昂贵，且需要仪器辅助。目前的DCIP显色法测量结果不准确，存在较大的偏差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种葡萄糖脱氢酶酶活测定方法，测量结果准确，偏差小。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种葡萄糖脱氢酶酶活测定方法，包括以下步骤：

S1.在PMS反应溶液中加入待测的葡萄糖脱氢酶液，反应完成后立即加入酸调节溶液pH≤3.0终止葡萄糖脱氢酶反应，离心、去除上清液保留沉淀；

S2.取DCIP检测溶液，测量DCIP检测溶液在600nm处的初始吸光值，在S1的沉淀中加入DCIP检测溶液，得到混合溶液，反应结束后再次测量混合溶液在600nm下的反应后吸光值，将反应后吸光值与初始吸光值的差值代入DCIP标准曲线计算得参与反应的DCIP摩尔质量，计算得葡萄糖脱氢酶的酶活数值。

采用现有的DCIP显色法测量过程中发现，反应体系中存在两个问题：