[发明专利]一种基于ERA技术的白斑综合症病毒快速检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供一种基于ERA技术的白斑综合症病毒快速检测方法及试剂盒，所述方法包括以下步骤：(1)ERA特异性引物和探针设计：上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，所述探针依序包括SEQ IDNO:3，THF，SEQ ID NO:4和C3间臂；(2)提取待测样品DNA；(3)将设计的特异性引物和探针添加至ERA检测体系中进行ERA检测。本发明的白斑综合症病毒的ERA引物和探针可以有效扩增靶基因，灵敏度达到10supgt;0/supgt;copies/μLcopies/μL。检测特异性高，与传染性皮下及造血组织坏死病毒、副溶血弧菌、肝肠胞虫以及健康对虾DNA均无交叉反应。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于ERA技术的白斑综合症病毒快速检测方法及试剂盒。

背景技术

凡纳滨对虾是我国水产养殖的重要经济品种之一。随着对虾产业的发展，养殖行业也面临多种致病原的出现。其中，白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是全球甲壳类动物水产养殖中最普遍的病毒。WSSV感染通常在3-10d内造成高达100％的死亡率。针对WSSV的感染，目前并无十分有效的治疗方案，因此有必要建立一种白斑综合症病毒快速检测的方法，在早期做出感染状态的诊断，能够有效避免产生巨大的经济损失。目前，已经开发出多种方法来检测WSSV，基于其靶向蛋白质或DNA可以分成两类，一类是免疫学检测，另一类是分子生物学检测。免疫学检测主要包括：酶联免疫技术(ELISA)、免疫胶体金技术以及免疫荧光抗体技术，免疫学检测技术由于检测灵敏度较低，制备抗体的步骤繁琐，成本较高且耗时长等不利条件，限制了其在现场检测中的应用。目前，分子生物学检测技术已广泛应用于病毒和其他病原体的检测。根据扩增温度，可以将分子生物学检测技术分为变温扩增检测技术和等温扩增检测技术，包括聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)、荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)、巢式PCR(nest PCR)、绝缘等温PCR(insulated isothermal PCR，iiPCR)、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)。PCR需要成本较高的热循环仪器，操作复杂且耗时长。LAMP技术作为常见的等温扩增技术，仍存在一定的缺点和不足，例如引物设计复杂、反应温度需要60℃左右且反应时间较长，这些不足均限制了其在现场检测中的应用。酶促重组等温扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)是中国苏州先达基因科技有限公司开发出的等温扩增技术，具有快速简便、操作简单、结果可靠的优点。目前还没有将ERA技术应用于快速检测凡纳滨对虾中的白斑综合症病毒的报道。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明通过基因组序列比对分析，选取白斑综合症病毒的保守区域VP28基因作为检测的靶基因，并针对靶基因序列设计了ERA检测引物和探针，建立了检测白斑综合症病毒的ERA技术。

本发明所采用的技术方案如下：

一种基于ERA技术的白斑综合症病毒快速检测方法，包括以下步骤：

(1)ERA特异性引物和探针设计：

上游引物:5’-ACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCC-3’

下游引物:5’-TCCGCATCTTCTTCCTTCATCTGTGCATCA-3’

探针:依序包括TTGGATCAGGCTACTTCAAGATGACTGATGTGT，THF，CTTGACAGCGACACCTT和C3间臂；

(2)提取待测样品DNA；

(3)以待测样品的DNA为模板，采用步骤一设计的引物和探针进行ERA反应，得到ERA扩增产物并检测荧光信号强度。