[发明专利]一种阿留申、肠炎、犬瘟热病检测的方法

说明书

本发明涉及生物检疫领域，具体涉及一种用于水貂阿留申病毒、肠炎病毒、犬瘟热病毒的三重TaqMan荧光定量PCR的引物和探针及其应用。该方法仅特异性扩增CDV、AMDV和MEV，与水貂的其他病原无交叉反应，特异性强；对AMDV与MEV、CDV的质粒标准品的最低检测限为7.5×10¹copies/μL，具有较高的敏感性；组内和组间的变异系数均小于4％，具有良好的重复性。

技术领域

本发明属于生物检疫领域，具体涉及一种三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。

背景技术

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)是一种急性、高度接触性传染病，主要侵害易感动物的消化系统、神经系统和呼吸系统，致使水貂发病后，死亡率可高达30-80％，在雪貂上高达100％。CDV感染宿主范围广，目前已从犬科动物和鼬科动物、浣熊科、食肉目所有8个科及偶蹄目猪科、灵长目猕猴属等多种动物体内分离到该病毒，近年来我国多地也相继暴发该病毒病，临床表现为出现明显的神经症状、体温升高、饮食欲下降，消化不良，口鼻部皮肤炎症、角化增厚结痂、排出腥臭味粪便，严重者衰竭而亡。尽管减毒疫苗在过去几年中大大降低了死亡率，并部分控制了该疾病，但在犬和野生动物宿主中仍报告了几次CDV的暴发。已成为严重危害养犬业、经济动物养殖业、野生动物保护事业的传染病之一。

水貂阿留申病毒(Mink Aleutian virus，AMDV)是一种细小病毒，可引起免疫复杂反应，导致水貂发生阿留申病。AMDV在其他种类的鼬科中也发现了自然感染，包括欧洲、日本和北美的雪貂、水貂(黄貂)、水貂、水獭。除了麝鼠科，还在浣熊、臭鼬、山猫、和狐狸中发现了AMDV感染的证据。AMDV可引起高丙种球蛋白血症、高抗AMDV抗体水平、感染性免疫复合物的形成和肾小球肾炎。死亡通常由肾功能衰竭引起。临床症状包括贫血、厌食症、凝血异常和不孕症。传播发生在水平和垂直传播，病毒存在于受感染动物的粪便、尿液和唾液中。由于该病的病原感染机制特殊，所以到目前为止，没有公认的免疫效果好的疫苗，也没有特效疗法，故对其防治极其困难。国内仅仅只能依靠检测阳性，淘汰净化来清除该病，但收效甚微。有国外学者从基因和蛋白水平对AD的研究较为深入，对其发病机理也日渐清晰。

水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)是细小病毒科细小病毒属的一员，是一种单链DNA病毒。MEV引起水貂病毒性肠炎，这是一种急性和高传染性的疾病，MEV主要感染肠系膜淋巴结和小肠上皮细胞，导致厌食、呕吐、严重腹泻和淋巴细胞减少，病毒主要通过粪便口服途径传播。MEV的诊断是控制该疾病的一个重要措施，尽管MEV现在有多种诊断方法，但是各种方法却存在着各自的缺点。例如，虽然电子显微镜和病毒分离具有高度的特异性和敏感性，但它们对于常规临床使用来说往往过于耗时和昂贵。此外，血液凝集试验(HA)快速但缺乏特异性，血凝抑制试验(HI)需要持续供应新鲜红细胞，不适合检测非血凝MEV分离株。近年来，尽管已有一种疫苗被用于预防该疾病的进一步传播，但感染的数量仍在继续增加。这可能与MEV持续突变的能力有关。

目前，国内外学者针对以上病原建立了RT-PCR、多重RT-PCR、荧光定量RT-PCR、ELISA等检测方法，但尚无同时区别检测CDV、MEV及AMDV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的报道。

发明内容

本研究针对CDV、MEV及AMDV特定基因，设计特异性引物和荧光探针，建立了同一体系中同时鉴别检测CDV、MEV及AMDV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法，并应用于临床检测，为相应病原的检测和流行病学调查提供特异、高效、敏感的技术手段。具体技术方案如下：

(1)样品采集与制备

(2)病毒核酸提取

(3)取反应体系管置于室温融化，用移液器吸取模板2μL加入反应体系管中，用离心机离心30s，离心结束放入荧光定量PCR仪器中，使用程序进行扩增检测。