[发明专利]一种利用TR-FRET检测DNA聚合酶活性抑制率的方法及应用

说明书

本申请涉及一种利用TR‑FRET检测DNA聚合酶活性抑制率的方法以及应用。该方法构建了抑制剂浓度与DNA聚合酶活性抑制率的拟合方程。所述方法能够特异性的检测由DNA聚合酶活性生成的特异性的dsDNA，而不受体系内污染的非特异性的dsDNA的影响，提高了检测结果的准确性；且所述方法引入了TR‑FRET技术的优点，可以排除系统内荧光的干扰，进一提升了检测结果的准确性。另外，通过底物序列的设计以及具体核苷酸荧光标记的形式可以针对性地筛选检测不同核苷酸种类的类似物。因此利用所构建的方法能够较好地应用于能够抑制DNA聚合酶活性的小分子药物，尤其是特定核苷酸类似物的高通量检测中。

技术领域

本申请涉及荧光检测和分子生物学技术领域，尤其是涉及一种利用TR-FRET检测DNA聚合酶活性抑制率的方法及在小分子药物检测中的应用。

背景技术

现有技术中针对小分子药物的检测采用方法为POLQ Picogreen。该方法的检测原理是待检测化合物样品抑制POLQ(DNA聚合酶θ)的活性，进而阻止dsDNA形成。该方法需要检测POLQ聚合产生DNA双链的量，原理是Picogreen仅在与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下，可以选择性地检测低至25pg/ml的dsDNA(原理图如图1所示)。该分析在三个数量级范围内呈线性，且几乎无序列依赖性，可以精确地测量多个来源的DNA，包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。可用荧光分光光度计或荧光酶标仪读数，Ex/Em＝490nm/520nm。

但是上述方法具有以下缺点：1.正如上述检测原理介绍，该检测方法是定量dsDNA，几乎无序列依赖性，可以精确地测量多个来源的DNA，这样就不能特异性识别实验中反应生成的特异dsDNA产物，检测结果会受到体系内污染的ds DNA的影响。2.POLQPicogreen检测的信号是绿色荧光信号490nm的激发光和520nm的发射光，这类荧光强度的检测方法容易受到待筛选的小分子药物的荧光干扰，同时也会受到来自反应体系，例如实验板、反应缓冲溶液成分等绿色荧光干扰，导致检测结果的假阴性等；因此该方法在进行高通量筛选过程中会产生的大量的假阴性。3.上述方法的检测是基于待检测化合物样品抑制POLQ的活性进而阻止dsDNA 形成，但该聚合酶的抑制剂中有一类底物核苷酸类似物的小分子药物，而该方案并不能有效的区分所筛选的底物核苷酸类似物分子的具体类似物种类。

因此需要提供一种新的用于小分子药物的筛选的方法，以克服上述缺陷。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本申请构建了一种利用TR-FRET检测抑制剂对DNA聚合酶活性抑制率的方法，所述方法能够特异性的检测由DNA聚合酶活性生成的特异性的dsDNA，而不受体系内污染的非特异性的dsDNA的影响，且所述方法引入了TR-FRET可以排除系统内荧光的干扰，提升了检测结果的准确性，且通过底物序列的设计以及具体核苷酸荧光标记的形式可以针对性地筛选检测不同核苷酸种类的类似物。因此利用所构建的方法能够较好地应用于能够抑制DNA聚合酶活性的小分子药物，尤其是核苷酸类似物的高通量检测中。

为此，本申请第一方面提供了一种利用TR-FRET检测DNA聚合酶活性抑制率的方法，所述方法包括以下步骤：

S1，将系列浓度的DNA聚合酶抑制剂的溶液分别添加在不同的反应容器内；向所述反应容器内分别加入DNA聚合酶溶液，混合后进行第一次孵育；

S2，向所述反应容器内分别加入含有底物模板和dNTP的溶液后进行混合；然后向所述反应容器内分别加入包含标记有镧系元素的特异性配对成员中的一员的溶液，混合后进行第二次孵育；其中所述dNTP中的其中一种核苷酸标记有荧光基团，所述底物模板上标记有特异性配对成员中的另一员；

S3，采用激光照射所述反应容器，记录不同的反应容器在所述荧光基团的吸收波长和发射波长下的荧光信号值，并计算在不同浓度的DNA 聚合酶抑制剂存在下，所述荧光基团发射波长下的荧光信号值与吸收波长下的荧光信号值的比值；